毛淑紅，馬曉雨，張朝暉，王曉蕊，王 珊，路福平，劉逸寒

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)，又稱為絲氨酸磷脂、二酰甘油酰磷酸絲氨酸[1]，是大腦細胞膜的重要組成成分之一[2]，其在激活腦細胞的過程中起著非常重要的作用[3].PS能夠顯著緩解壓力、加速恢復(fù)用腦疲勞、平衡情緒[4]；還可以與 DHA 相互促進吸收，有助于保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)[5]，從而促進胎兒智力的發(fā)育.此外，PS是一種有效的運動營養(yǎng)補充品，可以對抗運動引起的壓力，并通過減緩運動引起的皮質(zhì)醇水平升高來防止生理惡化[6].因此，PS被譽為繼膽堿及“腦黃金”DHA 后，又一大新興的“智能營養(yǎng)素”[7]，是一種相對安全、潛在有效的治療劑[8]，可應(yīng)用于功能食品和制藥行業(yè)中.

但是，PS在動植物中含量較少，制備困難.傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是從動物器官中提取(如牛腦等[9])，但由于傳染性疾病(如牛海綿狀腦病)的存在使之暗含一定的安全隱患[10].目前，主要采用以大豆為原料進行提取，但原料利用率及產(chǎn)率較低[11].因此，利用磷脂酶D(phospholipase D，PLD)催化磷脂酰膽堿(PC)與L-絲氨酸轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，實現(xiàn)酶法合成PS，成為其制備的一個新思路.磷脂酶是在生物體中存在的能水解甘油磷脂的一類酶，其中 PLD可以特異地作用于磷脂分子中的磷酸二酯鍵，被廣泛用于甘油磷脂的改造[12].大多數(shù) PLD的來源菌株為鏈霉菌屬[13]，主要由土壤中篩選獲得[14].除此之外，棒狀桿菌(Corynbacterium)[15]、大腸桿菌(Escherichia coli)[16]、副流感嗜血桿菌(Haemophilus parainfluenza)[17]以及假單胞菌(Pseudomonas)[18]等微生物中也相繼發(fā)現(xiàn) PLD 的存在.與動植物來源 PLD相比，微生物尤其是鏈霉菌來源的 PLD具有較強的底物耐受特性、較好的底物專一性以及較高的催化活性，因而備受關(guān)注.

為進一步提高PLD的生產(chǎn)水平，減少純化步驟，降低生產(chǎn)成本，國內(nèi)外對鏈霉菌 PLD的研究主要集中在 PLD的異源表達方面.Hatanaka等[19]獲得了來源于間隔鏈霉菌(Streptomyces septatus)TH-2的PLD，并分析其水解活性，發(fā)現(xiàn)水解活性的最適溫度為50℃，最適pH為5.0；Nakazawa等[20]分離得到一株鏈霉菌 10-3，其具有較高的 PLD 水解活性，最適溫度及 pH分別為 50℃和 7.5；可見，圍繞鏈霉菌來源 PLD的性能分析主要體現(xiàn)在水解活性上.另外，Tao等[21]將郝氏鏈霉菌(S. halstedii)來源 PLD 在不同的宿主中進行表達，發(fā)現(xiàn)以變鉛青鏈霉菌(S. lividans)為宿主同源表達時，PLD 活性可達69.12U/mL，而在大腸桿菌(Escherichia coli)和畢赤酵母(Pichia pastoris)中 PLD表達活力較低，分別為1.21U/mL和 2.36U/mL；Hou等[22]利用谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)異源表達來源于鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)的 PLD，經(jīng)優(yōu)化表達后使PLD活力達到 1.90U/mL，為初始活力的 7.6倍.但是到目前為止，圍繞pld基因在枯草芽胞桿菌中表達的報道仍相對較少.枯草芽胞桿菌作為重要的工業(yè)發(fā)酵宿主菌株之一，具有食品級安全性[23]、無內(nèi)毒素、可胞外分泌外源蛋白[24]等優(yōu)點，以其作為表達宿主實現(xiàn)PLD的分泌表達，對于PS的高效制備具有重要意義.

因此，本研究利用枯草芽胞桿菌表達系統(tǒng)，對實驗室前期篩選獲得的郝氏鏈霉菌(Streptomyces halstedii)TCCC21102來源 PLD進行異源表達；在對其轉(zhuǎn)酯活性的酶學(xué)性質(zhì)研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建單水相酶法催化合成 PS反應(yīng)體系，旨在為 PS在食品及制藥行業(yè)的應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

具有枯草芽胞桿菌密碼子偏愛性的來源于郝氏鏈霉菌(Streptomyces halstedii)TCCC21102的pld基因由蘇州金維智生物科技有限公司合成.宿主枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)WB600和表達載體pWB980均保存于本實驗室.

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶 HindⅢ、限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ、T4DNA 連接酶，寶生物工程(大連)有限公司；卡那霉素抗性，北京索萊寶科技有限公司；磷脂酰絲氨酸，Sigma-Aldrich公司；大豆卵磷脂(PC，≥90%)、L-絲氨酸，上海源葉生物科技有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、細菌 DNA提取試劑盒、切膠回收試劑盒，OMEGA Bio-Tek公司；其他試劑均為分析純.

1.1.3 培養(yǎng)基

枯草芽胞桿菌的培養(yǎng)使用 LB液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母提取物 5，氯化鈉 10，卡那霉素抗性(終質(zhì)量濃度為100μg/mL)，pH 7.0.

1×SP 鹽培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO4·3H2O 18.34，KH2PO46.0，(NH4)2SO42.0，MgSO4·7H2O 0.2，檸檬酸鈉1.0.

SPⅠ培養(yǎng)基(100mL)：1×SP鹽培養(yǎng)基 97.6mL，酪蛋白水解物(0.05g/mL)400μL，酵母汁(0.1g/mL)1mL，葡萄糖(0.5g/mL)1mL.

SPⅡ培養(yǎng)基(100mL)：由1×SP鹽培養(yǎng)基 99mL，CaCl2·7H2O(0.0147g/mL)500 μL，MgCl2·6H2O(0.1017g/mL)500μL，用于枯草芽胞桿菌WB600菌株感受態(tài)的制備以及轉(zhuǎn)化.

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將合成的 pld基因及載體 pWB980均采用限制性內(nèi)切酶 HindⅢ、BamHⅠ進行雙酶切，利用SolutionⅠKit進行連接，得到重組質(zhì)粒 pWB980-pld并測序比對成功.

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌

枯草芽胞桿菌 WB600接種單菌落于 LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)入SPⅠ培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長末期轉(zhuǎn)入 SPⅡ培養(yǎng)基，37℃、100r/min搖床培養(yǎng)1.5h；10mmol/L EGTA 20μL加入至上述 SPⅡ培養(yǎng)基的菌體中，37℃、100r/min搖床培養(yǎng) 10min；加入上述連接好的重組質(zhì)粒 pWB980-pld，100r/min培養(yǎng)30min，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至 220r/min，繼續(xù)培養(yǎng) 1.5h；離心去上清液后涂布于含有100μg/mL卡那霉素(Kan)的LB篩選平板，篩選陽性轉(zhuǎn)化子進行驗證，獲得枯草芽胞桿菌重組菌株WB600/pWB980-pld.

1.2.3 重組PLD的表達

將構(gòu)建完成的枯草芽胞桿菌 WB600/pWB980-pld在含有卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中37℃、220r/min進行發(fā)酵培養(yǎng)，每 12h進行取樣，4℃、4000r/min離心后收集上清液，進行重組 PLD(rPLD)活力檢測，每組 3個平行，將最高活力設(shè)為100%.同時，選取發(fā)酵 24h的上清液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測.

1.2.4 轉(zhuǎn)酯酶活力檢測

含有 1.3mmol/L PC、3.9mmol/L L-絲氨酸和10mmol/L CaCl2的1mL 0.2mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.5)于 40℃保溫 10min，加入稀釋的發(fā)酵上清液(1mL)，在40℃下反應(yīng)30min.

樣品檢測采用高效液相色譜進行檢測，色譜條件：色譜柱為硅膠柱(5μm，2.1mm×150mm)，流動相為 V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(磷酸)＝475∶25∶4，流量 0.30mL/min，紫外檢測器檢測波長 205nm，柱溫箱溫度25℃.

轉(zhuǎn)酯酶活力定義：在 1min內(nèi)可催化 PC生成1μmol PS所需的酶量.PLD活力(U/mL)按照式(1)計算.

式中：mps為PS的產(chǎn)量，μg；n為稀釋倍數(shù)；Mps為 PS的摩爾質(zhì)量，792.081g/mol；t為反應(yīng)時間，min.

1.2.5 重組PLD酶學(xué)性質(zhì)分析

rPLD 經(jīng)純化后(純化方法參考文獻[25])，分別進行轉(zhuǎn)酯酶活力的最適溫度和最適pH測定.

rPLD 最適溫度測定：在 20、30、40、50、60℃下進行酶活力測定.

rPLD 最適 pH 測定：在 pH 為 4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0下進行酶活力測定.

每組實驗分別進行3個平行，酶活力最高活性設(shè)定為100%，測定相對酶活力.

1.2.6 PS合成條件優(yōu)化

PS合成體系為 6mL，所用緩沖液為 0.2mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.5)，其中分別含有不同物質(zhì)的量比的 PC 和 L-絲氨酸(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)，即PC濃度為1.3mmol/L，L-絲氨酸濃度分別為 1.3、2.6、3.9、5.2、6.5mmol/L，10mmol/L CaCl2，4U/mL的 rPLD，經(jīng)40℃反應(yīng)12h后，通過測定PS產(chǎn)率以確定最佳底物物質(zhì)的量比；在最佳底物物質(zhì)的量比條件下，于 6mL 0.2mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.5)中分別加入不同酶量(1、2、3、4、5、6U/mL)的 rPLD，在 40℃下反應(yīng) 12h，通過測定 PS產(chǎn)率以確定最佳 rPLD用量；在最佳底物物質(zhì)的量比和rPLD用量條件、6mL 0.2mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.5)的催化體系中，分別在 40℃下反應(yīng) 6、12、24、36、48、60h，通過測定 PS產(chǎn)率以確定最佳反應(yīng)時間.

利用PS標準曲線按照式(2)計算PS產(chǎn)率.

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)枯草芽胞桿菌密碼子的偏愛性，經(jīng)密碼子優(yōu)化后的S. halstedii TCCC21102來源的pld基因全長為1542bp，與優(yōu)化前的原始基因相比，序列有464個堿基發(fā)生改變，并且GC含量由71.3%下降到44.3%；載體pWB980全長為4735bp.如圖1所示，pld基因及 pWB980質(zhì)粒經(jīng) HindⅢ和 BamHⅠ酶切后，條帶大小在1500bp(泳道1)和4700bp(泳道2)左右.

2.2 重組菌株的構(gòu)建

pld基因與 pWB980經(jīng)酶切連接后構(gòu)建獲得pWB980-pld，其質(zhì)粒圖譜如圖 2(a)所示.經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入枯草芽胞桿菌 WB600中，經(jīng)過卡那霉素抗性篩選，提取重組質(zhì)粒pWB980-pld(圖 2(b)，泳道1)，經(jīng) HindⅢ和 BamHⅠ雙酶切后獲得大小約為1500bp和 4700bp的兩條片段(圖 2(b)，泳道 2)，說明重組菌株WB600/pWB980-pld構(gòu)建成功.

圖1 pld基因及pWB980載體酶切圖Fig. 1 Restriction analysis of pld gene and pWB980 vector

圖2 重組質(zhì)粒pWB980-pld的質(zhì)粒圖譜以及酶切鑒定Fig. 2 DNA map and restriction analysis of the recombinant plasmid pWB980-pld

2.3 重組PLD的表達

2.3.1 重組PLD的表達與純化及其酶活力測定

收集重組菌株WB600/pWB980-pld的24h發(fā)酵上清液，以原始菌株 WB600作為對照，進行 SDSPAGE檢測，如圖 3所示.rPLD相對分子質(zhì)量約為5.50×104(泳道 1)，而對照菌株未見相應(yīng)條帶(泳道2)，表明rPLD成功在枯草芽胞桿菌中分泌表達.

2.3.2 重組PLD最佳表達時間的確定

不同發(fā)酵時間的rPLD活力如圖4所示.

圖3 重組菌株分泌表達rPLD電泳分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of extracellular rPLD of the recombinant strain

圖4 不同發(fā)酵時間的rPLD活力Fig. 4 rPLD activity at different fermentation time

由圖 4可知：在 12～60h，隨著發(fā)酵時間的延長，rPLD活力逐漸增加；當超過 60h后，rPLD活力有所下降.因此，選擇重組菌株 WB600/pWB980-pld發(fā)酵 60h，以實現(xiàn)對 rPLD 的高效表達分泌，此時酶活力達到 2.53U/mL.已報道的以 Escherichia coli、Pichia pastoris[21]以及Corynebacterium glutamicum[22]作為宿主細胞的 PLD表達水平分別為 1.21U/mL、2.36U/mL以及 1.90U/mL，上述活性主要是水解活性，直接測定轉(zhuǎn)酯活性的報道相對較少，但轉(zhuǎn)酯活性直接體現(xiàn) PLD催化生產(chǎn) PS的能力.有研究報道以Pichia pastoris[26]為宿主細胞獲得PLD的轉(zhuǎn)酯酶活力可達 2.37U/mL.本研究利用枯草芽胞桿菌作為宿主細胞，其表達鏈霉菌來源 PLD的轉(zhuǎn)酯活性有一定提高，且其對于 PS的安全生產(chǎn)具有非常重要的意義.因此進一步開發(fā)與研究基于枯草芽胞桿菌表達與調(diào)控工具，將有助于提高PLD的生產(chǎn)水平.

2.4 pH與溫度對重組PLD活性的影響

溫度與pH對轉(zhuǎn)酯酶活力的影響如圖5所示.由圖5可知：rPLD在pH和溫度分別為5.5和40℃時其轉(zhuǎn)酯活性最高.與之相近的是 Moon等[27]從土壤中分離得到菌株 Streptomyces sp. p821，其所產(chǎn) PLD的轉(zhuǎn)酯活性的最適溫度為 30℃，最適 pH為 5.0；而Simkhada等[28]對S. olivochromogenes中PLD進行酶學(xué)性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)酯活性的最適溫度高達75℃，最適pH為8.0.由此可見，不同來源的鏈霉菌PLD之間的性質(zhì)存在一定差異，且相同來源的鏈霉菌 PLD，其轉(zhuǎn)酯活性和水解活性的最適作用條件也并不相同，如 Simkhada等[28]發(fā)現(xiàn)來源于 S.olivochromogenes中PLD在55℃、pH為6.0時水解活性最高.因此，對 rPLD的轉(zhuǎn)酯活性條件進行測定，有助于進行其催化 PC和 L-絲氨酸轉(zhuǎn)酯合成 PS的研究.

圖5 溫度與pH對轉(zhuǎn)酯酶活力的影響Fig. 5 Effects of temperature and pH on transphosphatidyl enzyme activity

2.5 rPLD催化合成PS的工藝優(yōu)化

底物的物質(zhì)的量比是可逆反應(yīng)中使反應(yīng)平衡向所需產(chǎn)物移動的重要變量[29-30].在PLD催化合成PS的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)過程中，水在作為反應(yīng)介質(zhì)的同時還會作為L-絲氨酸的競爭性底物，生成水解產(chǎn)物磷脂酸.因此，可通過過量的 L-絲氨酸使反應(yīng)平衡向轉(zhuǎn)酯方向轉(zhuǎn)移，以達到提高轉(zhuǎn)酯率和降低水解率的目的，從而提升PS產(chǎn)率.rPLD單水相催化合成PS的條件優(yōu)化結(jié)果如圖6所示.

由圖 6(a)可知：隨著 PC與 L-絲氨酸物質(zhì)的量比的增加，PS的產(chǎn)率逐漸增加；當物質(zhì)的量比為 1∶3時，PS的產(chǎn)率達到最高，為 30%；隨著底物物質(zhì)的量比的繼續(xù)增加，轉(zhuǎn)化率并沒有顯著提高.因此，選擇 PC與 L-絲氨酸底物物質(zhì)的量比為 1∶3，用于催化反應(yīng)的進一步優(yōu)化.

由圖 6(b)可知，PS產(chǎn)率與酶的添加量顯著相關(guān)：當酶量由 1U/mL逐漸增加至 5U/mL時，PS產(chǎn)率隨之增加至 35.1%；在酶添加量為 6U/mL時，幾乎保持不改變.因此，考慮到反應(yīng)效率和酶的成本，選擇5U/mL為最佳添加量.

在PC與L-絲氨酸物質(zhì)的量比為1∶3、rPLD為5U/mL、溫度為 40℃、pH 為 5.5、0.2mol/L 醋酸-醋酸鈉緩沖液 6mL的反應(yīng)體系中，分析隨著時間進程的 PS產(chǎn)量變化.由圖 6(c)可知：0～24h，隨著時間的增加，PS的產(chǎn)率有所增長，最高可達 42.6%；24h后，PS產(chǎn)率下降.分析其原因可能是由于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)過程中存在著產(chǎn)物被水解及逆向轉(zhuǎn)酯的情況[31].

圖6 rPLD單水相催化合成PS的條件優(yōu)化Fig. 6 Optimization of the transphosphatidyl reaction system

目前，轉(zhuǎn)酯合成 PS的反應(yīng)體系介質(zhì)較多，如有機溶劑氯仿[16]、γ-戊內(nèi)酯[29]、二甲基四氫呋喃[32]、乙醚[33]、正己烷[34]、乙酸乙酯[35]等，在有機相-水相雙相催化體系中進行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)后，PS產(chǎn)率基本可達到90%以上，但是由于有機溶劑存在毒性，因此不利于PS的規(guī)模制備及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用；利用Triton X-100等表面活性劑[36]催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，雖然PS的產(chǎn)率能夠達到 94.7%，但造成其分離困難.因此，利用單水相進行酶法催化合成PS，盡管產(chǎn)率與使用上述介質(zhì)相比較低，但該工藝操作簡單安全，進一步利用酶的固定化技術(shù)[37]，提高酶的利用效率，將有利于降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)PS的規(guī)模制備.此外，改變催化介質(zhì)，如加入綠色無毒的新興溶劑——低共熔溶劑[38]等也可有助于提高產(chǎn)率.

3 結(jié) 論

利用枯草芽胞桿菌的表達分泌系統(tǒng)，實現(xiàn) S.halstedii TCCC21102來源PLD的分泌表達，在搖瓶發(fā)酵水平轉(zhuǎn)酯酶活力可達 2.53U/mL；進一步對其PLD的轉(zhuǎn)酯活性酶學(xué)性質(zhì)進行分析，其最適反應(yīng)溫度為 40℃，最適反應(yīng) pH為 5.5；經(jīng)單水相催化反應(yīng)體系優(yōu)化，在 40℃、pH 5.5的條件下，Ca2+濃度10mmol/L，大豆 PC與 L-絲氨酸的物質(zhì)的量比 1∶3，rPLD添加量5U/mL，反應(yīng)24h，PS產(chǎn)率可以達到42.6%.本研究為 PLD的異源表達及其酶法合成新資源食品 PS提供了技術(shù)支撐，為 PS在我國食品及醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)依據(jù).