方淑梅 侯雪 邱凱華 孔祥森 鞠世杰 梁喜龍

摘要：稻瘟病菌是重要的模式致病真菌，該菌引發(fā)的稻瘟病也是全球水稻最嚴(yán)重的病害之一，因此對稻瘟病菌的研究具有重要的學(xué)術(shù)意義和實際價值。細(xì)胞周期受多層次、多因子共同調(diào)控，其相關(guān)控制蛋白在真菌的形態(tài)建成、發(fā)育分化、逆境適應(yīng)及致病性等方面發(fā)揮重要作用。為明確稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白的生物信息學(xué)特性，利用多種生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)站對獲得的3種細(xì)胞周期控制蛋白Cwf19、Cwf16和Cwf14的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、分子進(jìn)化、翻譯后修飾、空間結(jié)構(gòu)、互作蛋白等進(jìn)行分析，探討了其可能的作用機制，為進(jìn)一步利用反向遺傳學(xué)手段深入研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：稻瘟病菌;細(xì)胞周期控制蛋白;生物信息學(xué)

中圖分類號：S435.111.4+1?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0060-06

收稿日期：2020-07-08

基金項目：黑龍江省自然科學(xué)基金（編號：C2016047）;黑龍江省教育廳項目（編號：12531452）;黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目（編號：YJSCX2019-Y14）。

作者簡介：方淑梅（1977—），女，遼寧東港人，博士，副教授，主要從事植物逆境分子生物學(xué)等方面的教學(xué)和科研工作。E-mail：fangshumei520@126.com。

通信作者：梁喜龍，博士，教授，主要從事植物化控及生物逆境方面研究。E-mail：xilongliang@126.com。

稻瘟病菌（Pyricularia oryzae or Magnaporthe oryzae）是重要的模式植物致病真菌，在真菌的科學(xué)研究中具有重要地位。而且由稻瘟病菌引起的稻瘟病是在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的最嚴(yán)重的病害之一，調(diào)查顯示全球受影響國家多達(dá)80個，每年受稻瘟病災(zāi)害導(dǎo)致的水稻減產(chǎn)率高達(dá)全世界水稻總產(chǎn)量的10%～30% [1]。而我國一直以來水稻種植業(yè)飽受稻瘟病的困擾，每年的產(chǎn)量損失高達(dá)30億kg以上。另外稻瘟病菌還可侵染小麥、大麥和黍等禾本科作物[2]。因此對稻瘟病菌致病分子機制的研究對于發(fā)現(xiàn)防治稻瘟病菌的特異性作用靶點，為高效藥物研發(fā)提供科學(xué)可行的重要理論基礎(chǔ)。

細(xì)胞周期是受多層次、多因子共同調(diào)控的影響細(xì)胞分裂、分化和凋亡等所經(jīng)歷的過程。 細(xì)胞周期控制蛋白（cell cycle control protein）參與細(xì)胞正常運轉(zhuǎn)的蛋白質(zhì)，是真核生物生命進(jìn)程中重要的調(diào)控因子，可通過調(diào)控細(xì)胞周期而參與生命體的形態(tài)建成、生長發(fā)育、細(xì)胞分化、環(huán)境適應(yīng)及疾病發(fā)生等諸多過程[3-8]。研究顯示，許多pre-mRNA剪接因子是重要的細(xì)胞周期控制蛋白，通過參與剪接體的形成與RNA或其他蛋白結(jié)合而在剪接過程中發(fā)揮作用，從而影響基因表達(dá)[9-13]。

隨著稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫的公布以及遺傳重組手段的日益成熟，稻瘟病菌致病相關(guān)基因挖掘工作取得重要進(jìn)展[14-15]。然而對稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白的研究仍然較少。為此，筆者所在實驗室利用生物信息學(xué)方法分析了稻瘟病菌中的細(xì)胞周期控制蛋白的分子進(jìn)化、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征、序列特征及互作蛋白等，探討其可能的作用機制，旨在為進(jìn)一步利用反向遺傳學(xué)手段研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白的獲取與確定

利用稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http：//fungi.ensembl.org/Magnaporthe_oryzae/Info/Index），輸入檢索詞“cell cycle control protein”搜索，獲取所有細(xì)胞周期控制蛋白的基因ID和基因在染色體中的位置、外顯子數(shù)、編碼外顯子數(shù)等信息，并利用MapChart 2.2軟件，參照基因和染色體長度按比例進(jìn)行繪制。

1.2?稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白的理化特性及修飾位點預(yù)測

利用在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam）預(yù)測稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白的親水性和穩(wěn)定性;利用在線軟件SignalP-5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。利用在線軟件DISPHOS1.3（http：//www.dabi.temple.edu/disphos/）預(yù)測蛋白質(zhì)磷酸化位點，利用軟件GPS-SUMO 1.0預(yù)測蛋白質(zhì)的Sumo化位點，Sumoylation threshold和SUMO interaction threshold均設(shè)置為中等。

1.3?稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將稻瘟病菌細(xì)胞周期蛋白的氨基酸序列提交到NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），利用序列同源性獲取同源蛋白，整理為.fasta格式，然后利用軟件ClustalX 1.83進(jìn)行氨基酸序列的多重匹配分析，參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值，進(jìn)一步用MEGA 4.0軟件轉(zhuǎn)化為.meg文檔后，利用Neighbor-Joining法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4?稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

首先利用在線軟件NPS@SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page=/NPSA/npsa_sopma.html）進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析，窗口寬度17，相似性閾值8。利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在線網(wǎng)站預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，獲取3D模型及相關(guān)信息。

1.5?稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白的互作蛋白分析

互作蛋白預(yù)測利用STRING 11.0在線軟件（https：//string-db.org/cgi/input.pl）進(jìn)行，minimum required interaction score 設(shè)置為高置信度（high confidence）0.700，互作蛋白來源于試驗證實（Experiments）。

2?結(jié)果與分析

2.1?稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白及基因信息確定

通過在稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站搜索，獲得注釋為細(xì)胞周期控制蛋白的基因ID共3個，分別為 MGG_00102、MGG_12308和MGG_06309（表1），其所對應(yīng)的蛋白分別為Cwf19、Cwf16和Cwf14，來源菌株均為Pyricularia oryzae 70-15。

2.2?稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白基因的染色體定位

由表1和圖1可見，3種稻瘟病菌細(xì)胞周期蛋白基因MGG_00102、MGG_12308和MGG_06309分別位于5號、2號和4號染色體上，其中MGG_00102位于染色體末端，而MGG_12308和MGG_06309均分布在靠近染色體末端1/4處。

2.3?稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白的理化特性與亞細(xì)胞定位

由表2可以看出，3種蛋白質(zhì)的分子量差異較大，其中Cwf14分子量最小，為17 161.75 g/mol，Cwf16大約是它的2倍，而Cwf19分子量最大，大約是它的5倍;在等電點方面，Cwf14偏堿性，而Cwf19和Cwf16偏中性;3種蛋白均為不穩(wěn)定的親水性蛋白，均無信號肽，亞細(xì)胞定位分析顯示Cwf19和Cwf14僅存在于細(xì)胞核，Cwf16除位于細(xì)胞核外，還參與細(xì)胞骨架構(gòu)成。

2.4?稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白修飾位點預(yù)測

利用DISPHOS在線網(wǎng)站預(yù)測細(xì)胞周期控制蛋白磷酸化修飾位點顯示，Cwf19磷酸化位點共20個， 其中Ser 15個、Thr 2個、Tyr 3個;Cwf16磷酸化位點共5個，其中Ser 4個、Thr 1個，無Tyr磷酸化;Cwf14中無磷酸化位點。GPS-SUMO軟件預(yù)測3種蛋白質(zhì)的SUMO化位點結(jié)果如表3所示，Cwf19的具有1個SUMO化位點（181Lys）;Cwf16具有2個SUMO化位點（28Lys和156Lys）和1個SUMO互作基序（185-189Val-Val-Val-Ala-Gln）;Cwf14具有1個SUMO化位點（129Lys）。其中，距離Cwf19 SUMO化位點最近的磷酸化位點為173 Ser和190Ser，距離Cwf16 SUMO化位點最近的磷酸化位點為21Thr、36Thr和152Thr。

2.5?稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了明確稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白的進(jìn)化關(guān)系，本研究利用MEGA 4.0軟件，采用Neighbor-Joining法繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖2所示，3 種細(xì)胞周期控制蛋白均各自形成一組分支，表明他們在真菌的不同種屬間具有保守性。其中Cwf19，稻瘟病菌與小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces tritici）聚在一起，具有相同節(jié)點，親緣關(guān)系最近，而與新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）親緣關(guān)系最遠(yuǎn);對于Cwf16，稻瘟病菌與Microdochium bolleyi和Phaeoacremonium minimum具有較近的親緣關(guān)系，與二孢白粉菌（Golovinomyces cichoracearum）的親緣關(guān)系最遠(yuǎn);而Cwf14與稻瘟病菌親緣關(guān)系最近的是夏季斑枯病菌（Magnaporthiopsis poae），與向日葵間座殼菌（Diaporthe helianthi）的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.6?稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

本研究中細(xì)胞周期控制蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，3種細(xì)胞周期控制蛋白的二級結(jié)構(gòu)均以α螺旋為主，所占比例遠(yuǎn)高于其他2種形式。另外，Cwf16的α螺旋、β折疊和β轉(zhuǎn)角所占比例均最高于另外2種蛋白，表明其無規(guī)卷曲所占比例最小。

2.7?稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白的三級結(jié)構(gòu)

正確的空間構(gòu)象是蛋白質(zhì)具有特定生物學(xué)功能的前提。本研究利用在線預(yù)測軟件SWISS-MODEL預(yù)測細(xì)胞周期控制蛋白的3D結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表4和圖4所示。Cwf19的預(yù)測模板為6id0.1.R，三級結(jié)構(gòu)由2個大小不同的可能的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成;Cwf16的預(yù)測模板為6exn.1.F，三級結(jié)構(gòu)由1個結(jié)構(gòu)域和1個αα超二級結(jié)構(gòu)構(gòu)成;Cwf14的預(yù)測模板為3jb9.1.Z，為由1個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子。

2.7?稻瘟病菌細(xì)胞周期控制蛋白的互作蛋白預(yù)測分析

很多蛋白質(zhì)分子尤其是調(diào)控蛋白，在細(xì)胞內(nèi)通常都會與其他調(diào)控蛋白相互作用而發(fā)揮功能。本研究利用STRING在線軟件分別對3種細(xì)胞周期控制蛋白的互作蛋白進(jìn)行預(yù)測。所有互作蛋白分子均來源于試驗證實，最低互作閾值（minimum required interaction score） 設(shè)置為0.700。結(jié)果如表5所示，這3個蛋白的互作蛋白均為pre-mRNA剪接/加工因子或剪接體的組分，而且有些為他們共同的互作蛋白，如MGG_08133和MGG_08641同時與Cwf19、Cwf16和Cwf14互作，除此之外，MGG_01426和MGG_03116是Cwf19與Cwf16共同的互作蛋白，MGG_05616是Cwf19與Cwf14共同的互作蛋白，MGG_13500是Cwf16與Cwf14共同的互作蛋白。因此他們可能在pre-mRNA剪接過程中共同發(fā)揮作用。

3?結(jié)論與討論

對細(xì)胞周期調(diào)控的探索一直是真核生物重要的研究內(nèi)容之一。在真菌，許多細(xì)胞周期相關(guān)蛋白不斷地被發(fā)現(xiàn)和解讀，如Cln家族、Clb家族等，他們通過參與相關(guān)的信號通路而調(diào)控細(xì)胞的生長、發(fā)育以及致病菌株的毒力 [16-17]。除了這些直接作用的蛋白質(zhì)家族之外，細(xì)胞核中存在大量的調(diào)控蛋白，如剪接體構(gòu)成蛋白及剪接因子，他們通過調(diào)控基因表達(dá)而參與細(xì)胞周期的控制[9-13]。本研究中的3種細(xì)胞周期控制蛋白均存在于細(xì)胞核內(nèi)，以α螺旋為主要二級結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定親水性蛋白，他們的互作蛋白均為pre-mRNA剪接/加工因子或剪接體組分，因此推測這3種蛋白也是pre-mRNA剪接/加工因子或參與剪接體構(gòu)成的蛋白質(zhì)，參與 pre-mRNA 剪接或選擇性剪接。而且這3種蛋白在發(fā)揮作用時具有共同的互作蛋白，并且其中的MGG_01426和MGG_08641都參與細(xì)胞周期的控制過程，表明他們可能在共同的調(diào)控細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)的途徑中發(fā)揮作用。

SUMO（small ubiquitin-like modifier）化修飾通常指SUMO分子（76個氨基酸構(gòu)成的肽）通過其C端Gly結(jié)合于目的蛋白質(zhì)分子的Lys殘基上，也有些SUMO分子通過目的蛋白的SUMO互作基序（SUMO-interacting motifs，SIMs）與之結(jié)合，是常見的翻譯后修飾過程[18-19]。研究顯示SUMO化修飾參與蛋白質(zhì)的多種功能調(diào)節(jié)，包括影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、核酶活性、蛋白質(zhì)之間的相互作用、蛋白質(zhì)與核酸結(jié)合及亞細(xì)胞定位等[20-25]。本研究中的3個細(xì)胞周期蛋白均具有結(jié)合SUMO分子的位點或互作基序，因此SUMO化修飾可能在其發(fā)揮分子定位或參與剪接體組裝及作用中發(fā)揮作用。然而研究顯示并不是所有預(yù)測可能的SUMO位點都會真正地被SUMO分子結(jié)合，磷酸化修飾也可能在底物的SUMO化中發(fā)揮重要作用。Hietakangas等報道Lys-x-Glu-x-x-Ser-Pro是SUMO化位點的一致性序列，其中Ser的磷酸化可影響Lys的SUMO化 [26-27]。雖然本研究并未在這3種細(xì)胞周期控制蛋白中發(fā)現(xiàn)這種保守的序列，但是磷酸化與SUMO化之間的關(guān)系值得深入研究。

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