高 黎，劉 鑫，郭 姍，李藝博，張彥喜

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院兒童口腔科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科 鄭州 450052

釉質(zhì)白堊斑是口腔臨床常見現(xiàn)象，多見于特納牙、氟斑牙等，尤其是上前牙唇面，對美觀影響大，治療比較棘手。冷光美白是治療著色牙的常用方法，酸蝕是光固化樹脂修復的重要步驟。冷光美白及酸蝕對外傷及氟斑牙性白堊斑的影響未見報道。本文通過掃描電鏡、能譜分析觀察外傷性和氟斑牙性白堊斑結(jié)構(gòu)，以及酸蝕和冷光美白對其影響，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物、材料和設(shè)備清潔級SD大鼠孕鼠(河南省實驗動物中心)。一次性口腔器械盤(北京祥康科技有限公司)，氟化鈉晶體(天津市北辰方正試劑廠)，酸蝕劑(德國賀利氏格魯瑪公司)，冷光美白儀、冷光美白凝膠(美國Beyond Technology公司)，30 g/L戊二醛溶液、無水乙醇(武漢賽維爾生物科技有限公司)。Nikon照相機、掃描電鏡由鄭州大學材料與工程學院提供。

1.2動物模型的建立從50只1 d齡幼鼠中隨機選取10只不做任何處理，作為空白對照組(A組)。20只建立牙胚外傷模型(B組)[1]：用拉鉤拉住下唇，暴露下前牙牙槽區(qū)，在下頜前牙區(qū)順牙齒生長方向?qū)ο骂M骨垂直施加10 N/5 mm2的力，4周后引頸處死。20只建立氟斑牙模型(C組)：大鼠3周齡時，與母鼠分籠，基礎(chǔ)飼料及自來水適應性飼養(yǎng)1周后，自由飲用50 mg/L氟化鈉溶液，8周后引頸處死。

1.3實驗分組及處理選經(jīng)1.2項處理后的3組大鼠下頜切牙各18顆，共54顆。隨機分為9組，每組6顆。A0、B0、C0組：不做任何處理；A1、B1、C1組：酸蝕處理，牙齒表面均勻涂布體積分數(shù)37%的磷酸酸蝕劑，20 s后用蒸餾水反復沖洗，氣槍吹干；A2、B2、C2組：冷光美白處理，牙齒表面均勻涂布體積分數(shù)35%過氧化氫冷光美白凝膠，用冷光美白儀連續(xù)光照30 min，蒸餾水反復沖洗，氣槍吹干。

1.4各組大鼠下頜切牙的掃描電鏡和能譜分析樣本在無水乙醇中超聲蕩洗5 min，樣本干燥處理后將牙齒用導電膠固定在載物臺上，放入真空鍍膜機中鍍膜，用掃描電鏡對牙釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)進行觀察并拍照，測量牙釉質(zhì)表面鈣、磷元素含量。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行分析。對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，結(jié)果符合正態(tài)性和方差齊性；應用單因素方差分析和LSD-t檢驗對不同處理方式大鼠下頜切牙鈣、磷質(zhì)量百分比能譜分析結(jié)果進行比較。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1實驗動物模型下頜切牙大體標本見圖1。

2.2未處理的大鼠下頜切牙掃描電鏡和能譜分析結(jié)果見圖2、表1。掃描電鏡下：A0組大鼠下頜切牙表面平整光滑，無釉柱釉質(zhì)完整。B0組大鼠下頜切牙表面無釉柱釉質(zhì)層粗糙不平，有不規(guī)則裂隙及小的點狀缺損。C0組大鼠下頜切牙表面無釉柱釉質(zhì)點狀、片狀缺損。

A：空白對照組(牙齒表面光滑，有光澤，呈淡黃色)；B：牙胚外傷模型組(表面光滑，切端白堊色斑塊，頸部淡黃色)；C：氟斑牙模型組(表面光滑，切端白堊色斑塊，頸部棕黃色)

A：正常牙(×100)；B：正常牙(×500)；C：外傷牙(×100)；D：外傷牙(×500)；E：氟斑牙(×100)；F：氟斑牙(×500)

表1 未處理的大鼠下頜切牙鈣、磷質(zhì)量百分比能譜分析結(jié)果(n=6) %

2.3酸蝕處理后的大鼠下頜切牙掃描電鏡和能譜分析結(jié)果見圖3、表2。掃描電鏡下：A1組大鼠下頜切牙表面釉柱結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，呈有序的編織狀，釉柱與柱間隙界限分明，釉柱尖端呈錐形；B1組釉柱整體仍呈編織狀，排列輕度紊亂，釉柱邊緣呈毛刺樣改變，尖端失去規(guī)則的錐形形態(tài)；C1組釉柱失去編織狀，與牙面呈一定角度單向排列，細小，邊緣不整齊，尖端尖細。

A、B、C：正常牙(×600，×2 000，×5 000)；D、E、F：外傷牙(×600，×2 000，×5 000)；G、H、I：氟斑牙(×600,×2 000,×5 000)

表2 酸蝕處理后的大鼠下頜切牙鈣、磷質(zhì)量百分比能譜分析結(jié)果(n=6) %

2.4冷光美白處理后的大鼠下頜切牙掃描電鏡和能譜分析結(jié)果見圖4、表3。掃描電鏡下：A2組大鼠下頜切牙釉質(zhì)表面粗糙，有小而淺點狀凹陷；B2組釉質(zhì)表面有大面積小而深的凹坑狀微孔，呈蜂窩狀；C2組釉質(zhì)表面部分區(qū)域呈點片狀剝脫，邊界不清，呈鱗屑狀，其余區(qū)域釉質(zhì)較為正常，兩者呈不規(guī)則地圖樣交錯。

A、B、C：正常牙(×600，×2 000，×5 000)；D、E、F：外傷牙(×600，×2 000，×5 000)；G、H、I：氟斑牙(×600,×2 000,×5 000)

表3 冷光美白處理后的大鼠下頜切牙鈣、磷質(zhì)量百分比能譜分析結(jié)果(n=6) %

3 討論

3.1特納牙[2]是指由于乳牙根尖周嚴重感染或乳牙外傷導致繼承恒牙釉質(zhì)發(fā)育不全。Silberman等[3]將特納牙分為4種不同類型，主要為牙釉質(zhì)變色和缺損。有學者[4]對犬翻瓣暴露恒牙胚，在恒牙胚上直接加力，發(fā)現(xiàn)能夠有效對其切牙胚造成損傷。作者的前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，對45 d齡犬乳牙齊齦挫入導致繼承恒牙釉質(zhì)發(fā)育不全的發(fā)生率高達85%。對于實驗動物的選擇，由于實驗設(shè)計需要與氟斑牙形成對照實驗，故本實驗選擇大鼠作為實驗動物，而且大鼠牙齒的發(fā)生過程也使我們建模成為可能[6]：1 d齡時切齒正處于鐘狀晚期，而且下頜骨骨壁尚未發(fā)育完全，故選擇對1 d齡大鼠下頜骨施加創(chuàng)傷性外力。大鼠建頜完成是在6周齡，可正常行使咀嚼功能，這一特點又保證了牙胚外傷的形成完全是由于外力對牙胚的損傷，而非進食其他事物引起。作者預實驗發(fā)現(xiàn)，對1 d齡幼鼠暴露下前牙牙槽區(qū)，順牙齒生長方向施加10 N/5 mm2的力，可成功建立外傷性特納牙釉質(zhì)發(fā)育不全動物模型。

3.2氟斑牙是牙釉質(zhì)形成過程中過量攝入氟化物引起的牙釉質(zhì)低礦化，導致釉質(zhì)結(jié)構(gòu)異常。組織學表現(xiàn)為表層下的釉質(zhì)呈多孔性的礦化不良[7]。臨床上常按其輕、中、重而分為白堊型(輕度)、變色型(中度)和缺損型(重度)3種類型，其中白堊型表現(xiàn)為牙面失去正常光澤，出現(xiàn)不透明白堊色斑塊。對于動物模型的選擇，學者們已成功應用氟化飲水的方法復制出理想的氟斑牙動物模型[6-9]。相較于犬和猴，大鼠具有牙齒發(fā)育時間短，且終生不斷萌出的特點。有研究[1]表明，鼠切牙氟斑牙35 d更新1次，所以我們實驗選擇給予鼠氟化飲水1月，成功建立氟斑牙大鼠模型，其典型表現(xiàn)與以往研究結(jié)果相同。

3.3大鼠切牙表面釉質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察

3.3.1 表面未處理 低倍視野下3組大鼠下頜切牙表面都有無釉柱釉質(zhì)覆蓋，這也解釋了臨床所見釉質(zhì)雖表現(xiàn)為白堊斑，但表面仍光滑。鄭旭等[10]研究顯示，白堊斑病變部位多位于牙釉質(zhì)表層內(nèi)側(cè)邊緣，呈片狀損害，表面牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)基本完整。高倍視野下3組結(jié)構(gòu)略有不同：A0組表面無釉柱釉質(zhì)完整；B0組表面無釉柱釉質(zhì)部分覆蓋，表面略粗糙，有裂紋；C0組表面無釉柱釉質(zhì)部分覆蓋，表面粗糙，有點狀孔隙樣凹陷。文獻[11]報道，齲性釉質(zhì)白堊斑的原因可能是釉質(zhì)在細菌產(chǎn)酸的作用下脫礦，使得孔隙容積增大，孔隙中充滿空氣或水，這二者的折光率均低于釉質(zhì)。由此推測，氟斑牙及外傷性白堊斑形成的原因可能是釉質(zhì)釉柱不完整，裂紋及孔隙等改變了折光率所致。

3.3.2 酸蝕處理 去除表面無釉柱釉質(zhì)后，3組結(jié)構(gòu)明顯不同。A1組釉柱結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，呈有序的編織狀，釉柱與釉柱間隙界限分明，釉柱尖端呈錐形。B1組釉柱結(jié)構(gòu)與正常組相似，仍呈編織狀排列，柱間隙增寬，邊緣粗糙呈毛刺狀。由此推測，牙胚外傷只影響釉質(zhì)量的形成，而不影響釉質(zhì)堆積方式及方向，不影響其結(jié)構(gòu)，說明釉質(zhì)的形成機制未發(fā)生改變。外傷引起釉質(zhì)發(fā)育不全除直接損傷外，損傷相關(guān)分子模式機制可能也起重要作用。有研究[12-15]表明，創(chuàng)傷引起組織損傷的機制是作為損傷相關(guān)分子模式代表物質(zhì)的HMGB1通過結(jié)合促進炎癥的免疫受體，尤其是TLR4，引起核因子NF-κB的活化，使炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6分泌增加，從而引發(fā)局部組織炎癥免疫反應。由此推測牙胚外傷引起釉質(zhì)晶體細小是由于：牙胚組織細胞受到創(chuàng)傷，使正常存在于細胞內(nèi)的損傷相關(guān)分子釋放到細胞外，進入到組織間隙后，激活免疫細胞表面的PRRs，引起炎癥反應，破壞了牙胚釉質(zhì)分泌的有關(guān)細胞，繼而引起牙胚釉原蛋白、釉蛋白、成釉蛋白等的表達異常，最后造成牙齒的釉質(zhì)缺損。C1組釉柱晶體明顯細小，排列方向單一，與切牙唇面呈一定角度單向排列，釉柱邊緣不整齊，尖端明顯變細，與張慧[16]研究結(jié)果相似。由此推測，引起氟牙癥的高濃度氟不僅影響釉質(zhì)形成的量，而且影響了釉質(zhì)的沉積方式，導致釉柱單向排列而失去編織狀結(jié)構(gòu)。由于牙釉質(zhì)晶體的發(fā)生、成長是由分泌到釉質(zhì)基質(zhì)中的蛋白質(zhì)來執(zhí)行[17]，孫宏晨等[18]研究顯示，過量氟可引起分泌期及成熟期成釉細胞凋亡，使釉基質(zhì)蛋白(EMDs)分泌減少且不能被充分降解，進而干擾釉質(zhì)晶體的生長，導致釉質(zhì)結(jié)構(gòu)異常。EMDs主要包括釉原蛋白、成釉蛋白和釉蛋白。釉原蛋白在釉質(zhì)晶體形態(tài)結(jié)構(gòu)的形成過程中起著決定性作用，參與調(diào)控羥基磷灰石晶體的生長速度，調(diào)控晶體的生長方向，決定釉柱的結(jié)構(gòu)[18]。其中成釉蛋白作為非釉原蛋白中含量最多者，成釉蛋白基因敲除的小鼠，表現(xiàn)為嚴重的釉質(zhì)發(fā)育不全表型[19]。釉蛋白起維持和促進晶體生長作用[20]。作者的實驗結(jié)果提示高濃度氟可通過影響釉基質(zhì)蛋白的形成過程進而改變了氟斑牙釉質(zhì)晶體的方向，這為以后進一步研究氟斑牙釉質(zhì)發(fā)育不全的形成機制提供了新的思路。

3.3.3 美白凝膠處理 A2組牙齒表面輕微粗糙，無釉柱層未完全破壞，不影響正常結(jié)構(gòu)，可快速再礦化，與Li等[21]實驗結(jié)果相同；B2組釉質(zhì)表面有小而深的蜂窩缺損；C2組釉質(zhì)表面呈點片狀剝脫，剝脫區(qū)邊界不清，呈鱗屑狀，有的區(qū)域釉質(zhì)表面較為正常，兩者相互間呈不規(guī)則地圖樣交錯，其形態(tài)的改變同Wang等[22]實驗結(jié)果相同。作者的實驗結(jié)果提示強氧化劑對A2組及C2組影響較輕，對B2組影響較為明顯。作為冷光美白劑主要有效成分的過氧化氫具有強氧化性，以釉質(zhì)和牙本質(zhì)小管為通道，能夠快速與有機成分結(jié)合[23-24]。由于外傷造成釉柱細小而柱間質(zhì)相應增加，柱間質(zhì)有機成分含量高，所以冷光美白劑對B2組釉質(zhì)結(jié)構(gòu)影響較大。這提示在臨床上對著色牙進行冷光美白時，對于外傷性著色牙齒應注意保護白堊斑區(qū)域。

3.4大鼠切牙表面釉質(zhì)的能譜分析

3.4.1 表面未處理 A0組鈣磷含量>B0組>C0組，且A0組與C0組、A0組與B0組之間差異有統(tǒng)計學意義，可能是由于A0組釉質(zhì)表面無釉柱釉質(zhì)層完整，B0組及C0組表面無釉柱釉質(zhì)有缺損，而表層無釉柱釉質(zhì)的鈣磷含量高于深層釉質(zhì)，且C0組表層釉質(zhì)剝脫更嚴重。

3.4.2 酸蝕處理 3組鈣磷含量均升高，且組間差異無統(tǒng)計學意義?？赡苁禽^短的酸蝕時間，僅去除無釉柱釉質(zhì)并脫去釉柱間隙內(nèi)的有機成分，而保留了釉柱結(jié)構(gòu)，因此3組鈣磷含量均升高。3組間差異無統(tǒng)計學意義，說明氟斑牙和外傷所致的白堊斑區(qū)釉質(zhì)晶體的元素成分與正常牙齒相同。

3.4.3 冷光美白處理 正常牙齒冷光美白后鈣、磷含量下降，這與Cavalli[25]、Sulieman[26]等學者的研究結(jié)果一致，可能與過氧化氫使釉質(zhì)表面輕度脫礦有關(guān)。B2組和C2組冷光美白處理后鈣、磷含量均升高，且B2組白堊斑鈣、磷含量高于C2組。由于過氧化氫[27]是一種活潑的強氧化劑，能形成超氧化物自由基，其有不對稱電子，非常不穩(wěn)定，易與其他原子或分子結(jié)合，可切斷牙齒著色釉質(zhì)有機成分中未飽和的二價鍵，并與之結(jié)合，使其氧化分解為小分子物質(zhì)，最終變成CO2和H2O，并發(fā)散出牙體表面，所以強氧化漂白劑過氧化氫主要作用于牙齒中的有機質(zhì)成分。Kawamoto等[28]研究證明，強氧化劑對羥基磷灰石(HA)無破壞作用，但能降解牙本質(zhì)中的有機成分。由于外傷性白堊斑區(qū)域釉柱細小，相應有機成分多，所以導致外傷性白堊斑區(qū)鈣磷含量明顯升高；而氟斑牙性白堊斑雖然釉柱方向改變，但釉柱的量減小程度較外傷者小，所以其鈣磷含量有所升高但不如外傷者升高程度大。

綜上所述，外傷及氟斑牙性白堊斑無釉柱釉質(zhì)覆蓋不全。外傷性白堊斑釉柱變小，但排列方式未發(fā)生改變。氟斑牙性白堊斑釉柱排列方向單一且失去正常編織狀。冷光美白對兩種白堊斑區(qū)域均有影響，且對外傷性者影響更大。因此，在臨床上對外傷和氟斑牙性著色牙進行冷光美白時，應避開牙齒白堊斑區(qū)域，以免造成白堊斑區(qū)釉質(zhì)進一步破壞。