張楠楠，汪海斌，呂光達(dá)

(1 亳州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽 亳州 236800；2 國家中藥材產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，安徽 亳州 236800；3 亳州含量無憂中藥材檢測(cè)有限公司，安徽 亳州 236800)

中藥大黃為寥科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim, ex Balf. 或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根和根莖[1]。性寒，味苦，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)，是我國傳統(tǒng)的四大中藥之一。具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，利濕退黃之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，大黃有調(diào)節(jié)胃腸功能、抗病原微生物、抗炎、保護(hù)心腦血管、抗腫瘤、保肝利膽等作用[2-5]。

大黃藥材所含化學(xué)成分眾多，主要有蒽醌類、蒽酮類、二苯乙烯類、苯丁酮類、鞣質(zhì)類、多糖類等成分，其中，蒽醌類成分是其主要活性物質(zhì)[6-8]。眾所周知，中藥的質(zhì)量差異與其來源及產(chǎn)地有著很深的聯(lián)系。已報(bào)道的關(guān)于大黃藥材的相關(guān)文獻(xiàn)中[9-10]，掌葉大黃和唐古特大黃質(zhì)量較好，藥用大黃質(zhì)量較差。而產(chǎn)地不同，大黃的質(zhì)量差異也較大。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，對(duì)15批不同產(chǎn)地的掌葉大黃中游離蒽醌與總蒽醌的含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行聚類分析和主成分分析，以期為大黃的質(zhì)量評(píng)價(jià)及深入研究提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

1.1.1 試 材

掌葉大黃藥材共15批樣品由華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司提供，均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)周建理教授鑒定為掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根和根莖。詳細(xì)信息見表1。對(duì)照品蘆薈大黃素(批號(hào)110795-201609)；大黃酸(批號(hào)110757-201607)；大黃素(批號(hào)110756-201512)；大黃酚(批號(hào)110796-201520)；大黃素甲醚(批號(hào)110758-201415)來自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

表1 掌葉大黃詳細(xì)信息一覽表Table 1 List of detailed information of Rheum palmatum

1.1.2 儀 器

高效液相色譜儀，美國Waters e2695；Waters XBridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；KQ-205 型數(shù)控超聲清洗器，昆山超聲儀器有限公司；XMTD-7000電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士布奇有限公司；AX224ZH萬分之一天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；XPE56C百萬分之一天平，美國賽多利斯有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，線性梯度洗脫(0～5 min，70%A；5～6 min，70%→85% A；6～17 min，85% A；17～18 min，85%→70% A；18～22 min，70% A)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 混合對(duì)照品溶液

精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚適量，加甲醇分別制成每1 mL含蘆薈大黃素87.4 μg、大黃酸83.3 μg、大黃素80.7 μg、大黃酚81.8 μg、大黃素甲醚43.4 μg的對(duì)照品母液；分別精密量取上述對(duì)照品母液各2 mL，混勻，即得每1 mL中含蘆薈大黃素17.5 μg、大黃酸16.7 μg、大黃素16.1 μg、大黃酚16.4 μg、大黃素甲醚8.7 μg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.2.2 游離蒽醌供試品溶液

取本品粉末(過四號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.2.3 總蒽醌供試品溶液

取本品粉末(過四號(hào)篩)約0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系考察

精密吸取0.5、2、8、12、16 μL上述對(duì)照品母液，注入液相色譜儀，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的線性回歸方程：Y=4791X-35356，R2=0.9999；Y=3376.4X-37273，R2=0.9999；Y=3660.2X-22264，R2=0.9999；Y=5079.3X-33574，R2=0.9999；Y=869.41X-6965，R2=0.9998；結(jié)果表明，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進(jìn)樣量分別在43.7～1398.4、41.65～1332.8、40.35～1291.2、40.9～1308.8、21.7～694.4 ng 區(qū)間線性關(guān)系良好。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取上述混合對(duì)照品溶液，按“1.2.1”色譜條件連續(xù)測(cè)定。計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.46%、0.55%、0.77%、0.61%、0.98% (n=6)，說明儀器精密性良好。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取11號(hào)樣品，按“1.2.2.2”和“1.2.2.3”項(xiàng)下方法各制備1份供試品溶液，于制備后4、8、12、16、24 h按“1.2.1”色譜條件測(cè)定，計(jì)算游離蒽醌中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.43%、0.55%、0.51%、0.62%、0.87%，總蒽醌中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚面積的RSD 分別為0.76%、0.64%、0.80%、0.75%、0.93%，結(jié)果說明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取11號(hào)樣品，按“1.2.2.2”和“1.2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“1.2.1”色譜條件測(cè)定。計(jì)算游離蒽醌中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量平均值的RSD分別為0.52%、0.67%、0.63%、0.89%、1.17%；總蒽醌中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量平均值的RSD分別為0.66%、0.71%、0.69%、0.97%、1.33%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的11號(hào)掌葉大黃樣品0.2 g共6份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入混合對(duì)照品溶液適量，按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算游離蒽醌的回收率。

精密稱取已知含量的11號(hào)掌葉大黃樣品0.1 g 共6份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入混合對(duì)照品溶液適量，按“1.2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試溶液，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算總蒽醌的回收率。

回收率計(jì)算結(jié)果顯示，游離蒽醌和總蒽醌的加樣回收率為96.8%～102.1%，RSD值為0.83%～1.4%，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。

2.6 樣品含量測(cè)定

取15批不同產(chǎn)地的掌葉大黃進(jìn)行色譜分析，色譜圖見圖1。計(jì)算掌葉大黃中游離蒽醌和總蒽醌含量后，再計(jì)算結(jié)合蒽醌含量(總蒽醌含量-游離蒽醌含量)，結(jié)果見表2。

圖1 混合對(duì)照品及11號(hào)掌葉大黃樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances and Rheum palmatum sample No.11

結(jié)合表2可以看出，不同產(chǎn)地的掌葉大黃蒽醌類成分含量差異較大，甘肅宕昌掌葉大黃中游離蒽醌含量較高，結(jié)合蒽醌含量較低；青海玉樹與甘肅隴西掌葉大黃結(jié)合蒽醌含量較高，可能受到地理、氣候等因素的影響，不同產(chǎn)地掌葉大黃蒽醌類成分的富集程度也有所不同。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)Table 2 Determination results (n=2) (mg·g-1)

2.7 聚類分析

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)測(cè)得樣品的游離蒽醌、總蒽醌和結(jié)合蒽醌類成分的含量，將含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 19.0 軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖2。聚類閾值為5時(shí)，15批樣品分為4小類，即甘肅宕昌，陜西城固，青海玉樹，甘肅禮縣、甘肅隴西。閾值為10時(shí)，15批樣品分為3類，即甘肅宕昌為一類，青海玉樹為一類，陜西城固、甘肅禮縣、甘肅隴西為一類。閾值為15時(shí)，掌葉大黃樣品可以分為兩大類，即甘肅宕昌掌葉大黃為一類，其它產(chǎn)地掌葉大黃為一類。結(jié)果表明，除了甘肅禮縣和甘肅隴西兩個(gè)產(chǎn)地掌葉大黃有交叉外，產(chǎn)地相同的掌葉大黃樣品聚為一類，其蒽醌類成分含量相似。不同產(chǎn)地掌葉大黃的蒽醌類成分含量與其產(chǎn)地生長(zhǎng)環(huán)境存在著一定的聯(lián)系，甘肅禮縣和甘肅隴西掌葉大黃樣品，因海拔、產(chǎn)地相近，兩類差異較?。魂兾鞒枪毯０闻c甘肅隴西、禮縣比較相近，三者產(chǎn)地大黃差異較?。桓拭C宕昌、青海玉樹掌葉大黃可能因海拔與其它三地相差較大，各自聚為一類。

圖2 15批掌葉大黃聚類分析圖Fig.2 Hierarchical clustering analysis of 15 batches of Rheum palmatum

2.8 主成分分析(PCA)

將含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 13.0 軟件，以掌葉大黃中的游離蒽醌、總蒽醌和結(jié)合蒽醌類成分含量為X 變量，15個(gè)批次的掌葉大黃為Y 變量，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行PCA，見圖3。甘肅禮縣與甘肅隴西兩個(gè)產(chǎn)地掌葉大黃在分布上有區(qū)域交叉，陜西城固掌葉大黃又與甘肅禮縣、隴西的較接近，甘肅宕昌、青海玉樹掌葉大黃與其它產(chǎn)地的較為疏遠(yuǎn)，海拔高度越接近的居群，其主成分空間的分布位置也越接近，這也與上述聚類分析的結(jié)果相吻合。

圖3 15批掌葉大黃的PCA 圖Fig.3 The PCA score plot of 15 batches of Rheum palmatum

2.9 偏最小二乘判別分析(PLS-DA)

圖4 15批掌葉大黃的PLS-DA 得分圖Fig.4 The PLS-DA score plot of 15 batches of Rheum palmatum

圖5 15批掌葉大黃的PLS-DA 載荷圖Fig.5 The PLS-DA Load vector diagram of 15 batches of Rheum palmatum

圖6 蒽醌類成分的貢獻(xiàn)值(VIP 值)Fig.6 Variable importance of the anthraquinone components in the project value(VIP)

3 討 論

3.1 流動(dòng)相比例的考察

本實(shí)驗(yàn)分別比較了流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸溶液(85:15)、乙腈-0.1%磷酸溶液(80:20)等度洗脫以及乙腈-0.1%磷酸溶液(70:30)梯度洗脫比例，選用等度洗脫流動(dòng)相比例時(shí)，大黃樣品游離蒽醌中的蘆薈大黃素峰易受到雜峰干擾，分離效果較差，而梯度洗脫比例則能將蘆薈大黃素峰很好的分離，綜合考慮到分析蒽醌類化合物的含量，選擇乙腈-0.1%磷酸溶液(70:30)梯度洗脫作為流動(dòng)相。

3.2 氣溫、海拔對(duì)大黃蒽醌類成分的影響

特有的氣候因子條件有利于藥材活性成分的形成和積累，從而影響藥材品質(zhì)。有研究表明，氣溫是影響掌葉大黃品質(zhì)主要的氣候因子之一，對(duì)掌葉大黃化學(xué)成分含量的富集起到至關(guān)重要的作用[11]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在大黃的5個(gè)不同產(chǎn)地中，青海玉樹與甘肅隴西兩地掌葉大黃總結(jié)合蒽醌含量較高，結(jié)合5個(gè)產(chǎn)地的年平均氣溫分析，青海玉樹與甘肅隴西的年平均氣溫較其它三個(gè)產(chǎn)地低，推測(cè)可能是掌葉大黃藥材在低氣溫的影響下，更有利于其富集結(jié)合蒽醌類化合物。

同時(shí)，也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，大黃化學(xué)成分與海拔高度之間顯著相關(guān)[12-14]。至于其形成原因，認(rèn)為是不同海拔高度的土壤、光照、溫度和濕度等環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)的聚類分析和主成分分析結(jié)果也表明，同一海拔的掌葉大黃藥材中蒽醌類成分含量間存在相似性，海拔接近的甘肅禮縣、隴西兩個(gè)產(chǎn)地掌葉大黃在分布上有區(qū)域交叉，這可能從另一方面提示了海拔對(duì)掌葉大黃藥材品質(zhì)的影響。

3.3 不同產(chǎn)地大黃蒽醌類組分含量的差異可能導(dǎo)致其不同功效活性差異

結(jié)合大黃相關(guān)藥理學(xué)研究文獻(xiàn)表明，大黃中游離蒽醌類成分與其“清熱解毒”功效相關(guān)[15]，結(jié)合蒽醌類成分則與其“瀉下攻積”功效相關(guān)[16-17]，因此，不同產(chǎn)地大黃在蒽醌類組分含量上的差異，很有可能會(huì)導(dǎo)致其在不同功效上產(chǎn)生差異。以此推斷，在本次實(shí)驗(yàn)的5個(gè)產(chǎn)地掌葉大黃中，游離蒽醌類化合物含量最高的甘肅宕昌掌葉大黃，其清熱解毒功效最強(qiáng)；結(jié)合蒽醌類化合物含量較高的青海玉樹與甘肅隴西掌葉大黃，其瀉下作用可能較強(qiáng)。

4 結(jié) 論

本研究建立了HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地掌葉大黃藥材中蒽醌類成分含量的方法，同時(shí)對(duì)掌葉大黃的蒽醌類成分含量進(jìn)行了多元統(tǒng)計(jì)分析，15批掌葉大黃的聚類分析及主成分分析說明不同產(chǎn)地的掌葉大黃的蒽醌類化學(xué)成分與其產(chǎn)地、海拔等環(huán)境存在著一定的相關(guān)性，偏最小二乘判別分析篩選出總大黃酸、結(jié)合蒽醌大黃酸、結(jié)合蒽醌大黃素的VIP值均>1.2，表明這幾個(gè)成分可能是15批掌葉大黃樣品蒽醌類成分的主要差異標(biāo)志物，從而為大黃的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考依據(jù)。