孫志雙，姜小天，施溯筠

（延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林延吉133002）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又名北冬蟲夏草[1]，它與珍貴的中藥材冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）屬于同屬異種的真菌界植物，是藥用及食用價(jià)值很高的蟲菌復(fù)合體。蛹蟲草含有蟲草多糖、蟲草素、核苷類、甾醇[2]類等多種營(yíng)養(yǎng)成分。研究表明，蛹蟲草可以增強(qiáng)人體的免疫功能[3]；抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)[4]；抑制神經(jīng)系統(tǒng)、改善心腦血液循環(huán)、降血糖[5-6]等多種重要的生物學(xué)活性。具有很高的藥用價(jià)值和食用價(jià)值，它的藥效是各活性成分共同發(fā)揮作用的結(jié)果，且其療效與其質(zhì)量密切相關(guān)，因此建立準(zhǔn)確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)十分重要，本文在眾多活性成分中選擇了蟲草素、腺苷和麥角甾醇進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，可以用于比較不同產(chǎn)地被測(cè)物的含量差異，并根據(jù)不同成分的含量進(jìn)行選擇，為全面客觀地認(rèn)識(shí)蛹蟲草藥材功效物質(zhì)基礎(chǔ)、豐富和發(fā)展蛹蟲草藥材多指標(biāo)評(píng)價(jià)體系研究和蛹蟲草的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

張銘雅等[7]建立色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜方法同時(shí)對(duì)蛹蟲草中蟲草素、蟲草酸、腺苷和肌苷的含量進(jìn)行測(cè)定；常襯心等[8]建立了一種蟲草麥角留醇含量檢測(cè)及質(zhì)量控制方法；林宏琳等[9]建立高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（high performance liquid chromatography-serial presence detect，HPLC-SPD）法同時(shí)測(cè)定九苷肽蛹蟲草軟膠囊中還原型和氧化型谷胱甘肽的含量，但目前沒有同時(shí)測(cè)定蛹蟲草中蟲草素、腺苷和麥角甾醇的相關(guān)文獻(xiàn)。此外，高效液相同時(shí)測(cè)定法的應(yīng)用十分廣泛，可應(yīng)用在環(huán)境保護(hù)學(xué)、植物生態(tài)學(xué)、食品科學(xué)等方面，且結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于多種領(lǐng)域中物質(zhì)的定量分析，具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品（20161123）、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品（1129A023）：索萊寶科技有限公司；角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（J26M6K1）：上海源葉生物科技有限公司；超純水：延邊大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室；色譜甲醇（709292）：格瑞斯化工科技有限公司。其余試劑均為分析純。蛹蟲草：延吉市東市場(chǎng)，經(jīng)延邊大學(xué)藥學(xué)院施溯筠副教授鑒定為蛹蟲草。

DHG-9145A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：常州諾基儀器有限公司；UNIQUE-R20超純水機(jī)：廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司；ISO-9001電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；KQ5200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；80-2型離心沉淀器：上海耀特儀器科技有限公司；Hitachi Primaide高效液相色譜儀：天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為 DiamosilC18（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-水梯度洗脫，0～15 min，20%甲醇；15 min～20 min，20%～100%甲醇；20 min～45 min，100%甲醇。體積流量1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

1.2.2 溶液的配制

1.2.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液

精密稱取蟲草素1.54 mg、腺苷1.3 mg、麥角甾醇3.0 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成單一標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。分別精密量取適量上述單一標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，制成每1 mL含蟲草素51.33 μg、腺苷43.33 μg、麥角甾醇 100 μg的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液

取蛹蟲草適量，烘干，粉碎過60目篩。精密稱取蛹蟲草粉末0.5 g，加入25 mL甲醇超聲溶解，過濾，濾渣棄去，待濾液冷卻至室溫（23±2）℃后離心5 min（5 000 r/min），取上清液過0.45 μm微孔濾膜，得供試品溶液。

1.2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

按1.2.1項(xiàng)下色譜條件，精密吸取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀中，測(cè)定。

1.2.4 線性關(guān)系考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度：取1.2.2.1項(xiàng)下單一標(biāo)準(zhǔn)品貯備液梯度稀釋配制成蟲草素濃度為 5、15、25、35、45、55、65 μg/mL，腺苷濃度為 5、10、15、20、25、30、35 μg/mL，麥角甾醇 25、50、100、150、200、250、300 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。分別以蟲草素、腺苷和麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 精密度試驗(yàn)

取1.2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按1.2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批蛹蟲草藥材，按1.2.2.2項(xiàng)下方法制備溶液，分別于 0、2、4、8、10 h 進(jìn)樣，測(cè)定此批蛹蟲草中蟲草素、腺苷和麥角甾醇的峰面積。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批樣品適量，共9份，每3份為一組，分別精密加入低、中、高質(zhì)量的對(duì)照品適量，按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算加樣回收率。

1.2.9 含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地蛹蟲草藥材，按1.2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量（平行測(cè)定3組，取平均值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

混合標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高效液相色譜圖見圖1和圖2。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards

圖2 供試品高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of sample

結(jié)果如圖1和圖2，供試品溶液色譜圖中，蟲草素、腺苷和麥角甾醇的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖一致，且其分離度均大于1.5。

2.2 線性關(guān)系考察

利用HPLC在1.2.1項(xiàng)色譜條件下對(duì)1.2.2.1項(xiàng)下單一標(biāo)準(zhǔn)品貯備液進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（Y）對(duì)各物質(zhì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得蟲草素、腺苷和麥角甾醇的回歸方程分別為Y=52 187X-135 932（R2=0.999）、Y=36227X-42375（R2=0.9992）、Y=9340.8X-29987（R2=0.999 4）。結(jié)果表明，蟲草素、腺苷和麥角甾醇分別在5 μg/mL～65 μg/mL、5 μg/mL～35 μg/mL、25 μg/mL ～300 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.3 精密度試驗(yàn)

對(duì)樣品進(jìn)行精密度試驗(yàn)，結(jié)果蟲草素、腺苷和麥角甾醇峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為 0.97%、1.35%、1.20%，表明儀器精密度良好，符合試驗(yàn)要求。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)樣品進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果蛹蟲草中蟲草素、腺苷和麥角甾醇峰面積的RSD分別為0.98%、1.86%、1.69%，表明方法的重復(fù)性良好，符合試驗(yàn)要求。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)樣品進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，測(cè)定此批蛹蟲草中蟲草素、腺苷和麥角甾醇的峰面積，計(jì)算RSD分別為0.88%、1.18%、1.36%，表明供試品溶液中蟲草素、腺苷和麥角甾醇在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

對(duì)樣品進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表1。

表1 3種成分加樣回收試驗(yàn)Table 1 Recovery tests for three kinds of ingredients

2.7 含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地的蛹蟲草藥材進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果如表2。

表2 樣品含量測(cè)定Table 2 Sample content determination

3 討論與結(jié)論

紀(jì)曉朋[10]、任玉合等[11]和李怡霖[12]分別研究了光照度、光照時(shí)間、有色光照對(duì)蛹蟲草的生長(zhǎng)發(fā)育、活性成分、產(chǎn)量的影響，試驗(yàn)證明不同光源、光強(qiáng)、照射時(shí)間對(duì)其含量有所影響。李居寧等[13]研究表明蛹蟲草菌絲及子實(shí)體生長(zhǎng)對(duì)溫度十分敏感，為提高其產(chǎn)量與質(zhì)量可以實(shí)行變溫管理。閆麗麗[14]闡述了培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)介質(zhì)、不同發(fā)育程度及外源物質(zhì)添加等因素對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)發(fā)育、活性成分及產(chǎn)量的影響。

綜上，雖然目前蛹蟲草已經(jīng)可以進(jìn)行人工栽培，但子實(shí)體產(chǎn)量和品質(zhì)與天然的蛹蟲草在一定程度上有較大差別，其不同成分的含量也不同。本試驗(yàn)對(duì)3個(gè)不同產(chǎn)地蛹蟲草中的蟲草素、腺苷和麥角甾醇進(jìn)行測(cè)定，3種蛹蟲草樣品中測(cè)得的含量各不相同，可能是樣品的來源、生長(zhǎng)環(huán)境等不同造成了一定差異?？梢愿鶕?jù)不同需求選擇不同產(chǎn)地的蛹蟲草進(jìn)行使用：若想用于增強(qiáng)人體的免疫功能、減少病毒的傳播、殺滅病菌等作用可以選擇江蘇省的蛹蟲草，其蟲草素含量較高；若用于改善心腦血液循環(huán)、抑制神經(jīng)系統(tǒng)、抗輻射、抗癌、減毒可以選擇廣東省的蛹蟲草，其腺苷和麥角甾醇的含量較高。

作者曾取“1.2.2.1”項(xiàng)下單一對(duì)照品貯備液分別在200 nm～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果蟲草素在260 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，腺苷在262 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，麥角甾醇在282 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，在260 nm處也有較大的吸收，為保證各指標(biāo)成分均有適宜的靈敏度并減少干擾，最終本研究在260 nm處同時(shí)測(cè)定3種成分。甘賓賓等[15]表明甲醇-水提取體系比乙醇-水體系提取率更高，但在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，甲醇-水體積比7∶3提取時(shí)麥角甾醇未出峰，查閱江莉等[16]文獻(xiàn)，選用甲醇對(duì)麥角甾醇進(jìn)行提取，因此最終選用100%甲醇提取蛹蟲草。等度洗脫操作簡(jiǎn)單但不能同時(shí)測(cè)定多種目標(biāo)成分，選用甲醇和水梯度洗脫可以使目標(biāo)成分之間的色譜峰分離度良好，同時(shí)進(jìn)行多成分的有效測(cè)定，可通過同時(shí)測(cè)定3種成分的含量，為品質(zhì)優(yōu)良的藥材篩選提供鑒定基礎(chǔ)。

本文建立了高效液相法同時(shí)測(cè)定蛹蟲草中蟲草素、腺苷和麥角甾醇含量的方法，該方法有分離度好、準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，且目標(biāo)峰保留時(shí)間適中，可以快速、有效的測(cè)定蛹蟲草中蟲草素、腺苷和麥角甾醇的含量，具有良好的實(shí)用性，可作為蛹蟲草的質(zhì)量控制方法。