張致英，范小偉，賀 娜，張 瑤，趙一多，劉 芳，馬利鋒，康龍麗

（1.西藏民族大學(xué) 高原相關(guān)疾病分子遺傳機(jī)制與干預(yù)研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712082；2.西藏民族大學(xué)高原環(huán)境與疾病相關(guān)基因研究高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712082）

青藏高原是世界上最高的高原，平均海拔超過4000 m.人類學(xué)和遺傳學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，生活在西藏的世居人更容易適應(yīng)高原低氧的環(huán)境[1-2].西藏自治區(qū)作為我國西南邊陲省份，生活著藏族、蒙古族、維吾爾族、夏爾巴人等20 多個(gè)人群，各群體之間有著不同的歷史背景和地理環(huán)境.藏族是青藏高原的原住民，夏爾巴人至今仍屬我國未識(shí)別民族之一，對(duì)于藏族人和夏爾巴人的起源問題至今仍存有爭議.到目前為止，Y染色體和線粒體DNA 的研究已經(jīng)表明，現(xiàn)代藏族人的起源可以追溯到新石器時(shí)期的移民潮或者來源自黃河中上游流域[3-5]，或者來源于北亞人群[6].夏爾巴人最初是西藏藏族人，通過對(duì)夏爾巴人歷史和語言的研究發(fā)現(xiàn)，在500 年前部分藏族人從西藏東部移居到尼泊爾的珠穆朗瑪?shù)貐^(qū)，形成夏爾巴人[7].

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STRs）又稱為微衛(wèi)星DNA，是一類廣泛存在于人類基因組中的DNA 多態(tài)性基因座.該基因具有片段短、擴(kuò)增效率高、判型準(zhǔn)確等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別、人類群體遺傳學(xué)、多基因分子疾病診斷等領(lǐng)域.本研究選取了406 例藏族人和夏爾巴人，對(duì)15 個(gè)常染色體STRs 進(jìn)行分析以探究這2 個(gè)群體的遺傳多樣性，并分析二者的親緣關(guān)系和基因融合水平.同時(shí)將這2 個(gè)人群與世界各地不同人群進(jìn)行全面比對(duì)分析，以期更好地了解藏族人和夏爾巴人的起源.

1 研究對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究共采集406 份血液樣本，包括西藏日喀則定日縣的225 份藏族人血液樣本和日喀則聶拉木縣的181 份夏爾巴人血液樣本. 采樣遵循知情同意原則，收集的樣本來自于3 代均為同一民族并且無血緣關(guān)系的健康個(gè)體.此項(xiàng)研究經(jīng)過西藏民族大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意.

1.2 DNA 的提取、PCR 擴(kuò)增和STRs 分型

樣本DNA 的提取采用Walsh 的Chelex 法，直接從白細(xì)胞中獲取[8].15 個(gè)常染色體STRs 基因座具有很高的遺傳標(biāo)記價(jià)值，被許多國家運(yùn)用在法醫(yī)鑒定中，包括D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、vWA、TPOX、D18S51、D5S818 和FGA.在GeneAmp 9600PCR 儀上，使用AmpF STR Identifiler PCR 擴(kuò)增試劑盒（美國ABI公司）并按照產(chǎn)品說明進(jìn)行擴(kuò)增. 使用PRISM 3100 Avant DNA 分析儀（美國ABI 公司）對(duì)STR 產(chǎn)物進(jìn)行分析，用GeneScan 3.7 和Genotyper 3.7 分析軟件進(jìn)行STR 的基因分型.

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Cervus 3.0 軟件[9]進(jìn)行等位基因頻率、法醫(yī)學(xué)參數(shù)（Ho，觀察雜合度；He，期望雜合度；PIC，多態(tài)性信息含量；DP，個(gè)體識(shí)別能力；EPP，非父排除率；TDP，累積個(gè)體識(shí)別能力；CPE，累積非父排除率）以及哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)的計(jì)算.用Arlequin 3.5 軟件[10]計(jì)算和比較高原人群及世界范圍內(nèi)其他一些人群的遺傳距離Fst、平均數(shù)差異、分化指數(shù)、共祖系數(shù)、Slatkins 線性Fst.用Structure 2.3.4 軟件[11]推斷人群結(jié)構(gòu)并且將個(gè)體與預(yù)測(cè)人群進(jìn)行匹配.用R 軟件包和Distruct 1.1 軟件[12]繪制遺傳距離和群體遺傳結(jié)構(gòu)矩陣圖.

40 個(gè)人群包括：夏爾巴人（Sherpa）、西藏定日藏族（Tibetan_Tingri）、西藏拉薩藏族（Tibetan_Lhasa）、西藏昌都藏族（Tibetan_Changdu）、青海高原藏族（Tibetan_Qinghai）、云南彝族（Yi_Yunnan）、珞巴族（Lhoba）、西藏僜人（Deng）、甘肅漢族（Han_Gansu）、陜西漢族（Han_Shaanxi）、江蘇漢族（Han_Jiangsu）、云南漢族（Han_Yunnan）、廣東漢族（Han_Guangdong）、東鄉(xiāng)族（Dongxiang）、甘肅回族（Hui_Gansu）、寧夏回族（Hui_Ningxia）、喀什維吾爾族（Uygur_Kashi）、伊犁維吾爾族（Uygur_Yili）、俄羅斯族（Russian Inner-Mongolia）、朝鮮族（Korean）、畬族（She）、傣族（Thai）、葡萄牙人（Portuguese）、弗蘭德人（Flemish）、希臘人（Greek）、羅馬尼亞人（Romanian）、西班牙人（Spanish）、巴基斯坦人（Pakistan）、摩洛哥柏柏爾人（布里亞）（Berber_Morocco1（Bouhria））、摩洛哥柏柏爾人（阿斯尼）（Berber_Morocco2（Asni）；）、埃及柏柏爾人（Berber_Egypt）、埃及穆斯林（Muslim_Egypt）、埃及科普特人（Copt_Egypt）、也門人（Yemenese）、沙特阿拉伯人（Saudi Arabian）、伊朗人（Iranian）、科威特人（Kuwaiti）、阿曼人（Omanis）、納米比亞奧萬博人（Ovambo_Namibia）、坦桑尼亞人（Tanzan）.

2 結(jié)果與分析

2.1 藏族和夏爾巴人15 個(gè)STRs 等位基因的頻率分布

西藏藏族人和夏爾巴人的15 個(gè)常染色體STRs等位基因的頻率分布分別如表1 和表2 所示. 在藏族群體中15 個(gè)STRs 位點(diǎn)共檢測(cè)出141 個(gè)等位基因，頻率分布在0.0022～0.6222 之間. 在夏爾巴人群體中15 個(gè)STRs 位點(diǎn)共檢測(cè)出139 個(gè)等位基因，頻率分布在0.0028～0.5691 之間. 15STRs 的法醫(yī)學(xué)參數(shù)如表3 所示. 在藏族群體中，TPOX 位點(diǎn)的PIC 低于0.5（0.470）且DP 低于0.8（0.528），D3S1358 位點(diǎn)的DP低于0.8（0.795），TH01 位點(diǎn)的DP 低于0.8（0.715），其余位點(diǎn)的DP 均高于0.8，PIC 均高于0.5. 在夏爾巴人群體中，除D18S51（P = 0.0361）和FGA（P =0.0016）基因座外，其余基因座均符合哈迪-溫伯格平衡（P>0.05）.

表1 藏族人群15 個(gè)常染色體STRs 基因頻率分布Tab.1 Allele frequencies of 15 autosomal STRs in Tibetans

表2 夏爾巴人15 個(gè)常染色體STRs 基因頻率分布Tab.2 Allele frequencies of 15 autosomal STRs in Sherpas

表3 藏族人和夏爾巴人的法醫(yī)學(xué)參數(shù)Tab.3 Forensic parameters for Tibetans and Sherpas

2.2 遺傳進(jìn)化分析

中國西藏日喀則藏族人和夏爾巴人與其他已知群體間的遺傳距離如圖1 所示.由圖1 可知，中國日喀則藏族人及夏爾巴人與其他群體配對(duì)比較的遺傳距離值在0.00315～0.04203 之間. 與其他人群相比，中國日喀則藏族人、夏爾巴人和中國西藏拉薩人群間的遺傳距離較短（Fst=0.00315），其次是漢族人，而遺傳距離最遠(yuǎn)的是納米比亞人（Fst=0.04203）.僜人、畬族人和中國其他群體間的遺傳距離Fst 均在0.02 以上.中國日喀則藏族、夏爾巴人和中國的其他群體（包括來自其他地區(qū)的藏族人、漢族人）之間的遺傳距離遠(yuǎn)小于遺傳距離最大的非洲群體，其次是西亞群體.

圖1 藏族和夏爾巴人與世界范圍其他人群配對(duì)FstFig.1 Plots of pairwise Fst of Tibetans and Sherpas and other worldwide populations

本研究使用了一種基于遺傳模型的聚類方法，將藏族、夏爾巴人和其他人群之間的遺傳相似性進(jìn)行可視化[13].中國日喀則藏族人和夏爾巴人以及世界范圍內(nèi)其他一些人群的遺傳結(jié)構(gòu)如圖2 所示.

圖2 西藏和夏爾巴人與世界范圍內(nèi)其他人群的遺傳結(jié)構(gòu)Fig.2 Estimated population genetic structure of Tibetan and Sherpas，and other worldwide populations

由圖2 可以看出，中國藏族、中國夏爾巴人、中國漢族和中國朝鮮族具有顯著的遺傳相似性，而喀什和伊犁地區(qū)的維吾爾族與歐洲及中東群體具有顯著的遺傳相似性.中國藏族、中國夏爾巴人與非洲群體遺傳相似性極不顯著，這與本研究中遺傳距離分析的結(jié)果較為一致.

3 討論

STRs 群體遺傳多態(tài)性可以反映群體的分化歷史.本研究對(duì)西藏自治區(qū)日喀則藏族和夏爾巴人合計(jì)406人進(jìn)行了15 個(gè)常染色體STR 基因分型，在藏族人群中共檢測(cè)出141 個(gè)等位基因，頻率分布在0.0022～0.6222 之間，在夏爾巴人群中共檢測(cè)出139 個(gè)等位基因，頻率分布在0.0028 ～0.5691 之間.國內(nèi)外學(xué)者對(duì)STRs 位點(diǎn)遺傳多態(tài)性的評(píng)價(jià)有不同的標(biāo)準(zhǔn)：Gill 等[14]認(rèn)為DP≥0.9 的基因座具有高鑒別力，而國內(nèi)學(xué)者[15-16]認(rèn)為當(dāng)DP ＞0.8 時(shí)，該基因座具有高度多態(tài)性遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，有較高的應(yīng)用價(jià)值，PIC ＞0.5 時(shí)遺傳標(biāo)記具有高度的可提供信息性.本研究中，藏族人群僅TPOX位點(diǎn)的PIC 低于0.5（0.470），DP 低于0.8（0.528），D3S1358 位點(diǎn)的DP 低于0.8（0.795），TH01 位點(diǎn)的DP低于0.8（0.715），其余位點(diǎn)的DP 均高于0.8，PIC 均高于0.5.在夏爾巴人群中除D18S51（P=0.0361）和FGA（P=0.0016）基因座外，其余基因座均符合哈迪-溫伯格平衡（P＞0.05）.由此認(rèn)為，藏族人群中TPOX、D3S1358、TH01位點(diǎn)和夏爾巴人群中D18S51、FGA 位點(diǎn)的多態(tài)性不高，其余位點(diǎn)均屬于高度多態(tài)性遺傳標(biāo)記，這15個(gè)位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增后結(jié)合使用，具有很高的鑒別力，可用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別、親子鑒定和群體遺傳學(xué)研究等領(lǐng)域[17].

夏爾巴人被稱為高原登山者，但對(duì)于夏爾巴人的起源仍有爭議.一項(xiàng)通過夏爾巴人基因型數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，夏爾巴人和漢族人是現(xiàn)代藏族人的2 個(gè)祖先群體[18].也有研究通過對(duì)Y 染色體和mtDNA 多樣性進(jìn)行分析表明，夏爾巴人與藏族有著密切的親緣關(guān)系，藏族人是夏爾巴人的祖先[7].最近的一項(xiàng)研究也認(rèn)為藏族人是夏爾巴人的祖先[19].本研究從常染色體遺傳角度對(duì)他們的遺傳起源進(jìn)行分析，結(jié)果表明，中國藏族和夏爾巴人與漢族及其他東亞群體具有顯著的遺傳相似性，而與歐洲或中東群體的遺傳相似性不顯著.

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)僜人形成了一個(gè)獨(dú)特的群體，這可能是由于隔離和遺傳漂變的影響，因?yàn)樗麄兪且葬鳙C和采集為生的數(shù)量較小的群體[20].此前研究認(rèn)為，維吾爾人來源自歐亞人群，但從遺傳學(xué)的角度來看，維吾爾人是東亞和歐洲人群結(jié)合交流而來[21-22].中東群體似乎是源自歐洲和非洲人群，這與Yao 等[23]的遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致.

總之，本研究的數(shù)據(jù)提供了更多關(guān)于藏族和夏爾巴人遺傳起源的信息.研究結(jié)果表明，藏族和夏爾巴人與其他東亞人群在遺傳上有著高度的相似性.