郭鑫偉，張 洋，遲淑艷,3**，譚北平,2,3，姚亞軍，姚紅梅

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)動物精準(zhǔn)營養(yǎng)與高效飼料工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方水產(chǎn)與畜禽飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 湛江 524088；4.長沙興嘉生物工程股份有限公司, 湖南 長沙 410128)

鐵(Fe)作為魚類健康生長所需微量元素之一，參與肌紅蛋白和血紅蛋白的行成，并且以Fe2+或Fe3+的形式激活糖代謝酶，催化該過程中的多種生化反應(yīng)[1]。相比于無機(jī)態(tài)鐵和簡單有機(jī)酸鐵兩種形式，飼料中添加有機(jī)螯合鐵被認(rèn)為更易吸收，具有更高的生物活性[2-3]。甘氨酸鐵(Fe-Gly(II))和檸檬酸鐵比無機(jī)態(tài)的FeSO4能夠更有效地提高凡納濱對蝦(PenaeusvannameiBoone)蛋白質(zhì)效率和飼料效率[4]。然而，評價依據(jù)不同，鐵源的生物效價存在差異，當(dāng)分別以增重率和飼料效率為參考依據(jù)時，軍曹魚(Rachycentroncanadum)對蛋氨酸鐵的生物利用率和FeSO4是相似的，但當(dāng)以血清CAT活性為判據(jù)時，前者的生物利用率是后者的2.75倍[5]。目前關(guān)于鐵源如FeSO4、Fe-Gly(II)和羥基蛋氨酸鐵(Fe-MHA)的利用效果在豬[6]、肉仔雞[7-8]和小鼠[9]等陸生動物上已經(jīng)開展了比較研究，關(guān)于水產(chǎn)動物尤其是海水魚類的研究較少。

石斑魚目前已經(jīng)成為中國四大海水養(yǎng)殖魚類之一，珍珠龍膽石斑魚(Epinepheluslanceolatu♂×E.fuscoguttatus♀)由于其生長速度快、肉質(zhì)鮮嫩和抗病力強(qiáng)等優(yōu)勢已成為南海主養(yǎng)海水品種[10]。本研究分別添加無機(jī)態(tài)FeSO4、氨基酸螯合態(tài)Fe-MHA和Fe-Gly(II)3種鐵源，探討珍珠龍膽石斑魚飼料中適宜鐵源的應(yīng)用效果，以期獲得滿足石斑魚健康快速生長的微量元素Fe的適宜添加形式。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和養(yǎng)殖管理

參考有關(guān)魚類商業(yè)飼料及文獻(xiàn)[4，11-14]報道中Fe需要量，分別添加FeSO4、Fe-Gly(II)和Fe-MHA(純度均為99%，長沙興嘉生物工程發(fā)展股份有限公司)3種鐵源，配制3組等氮等脂的試驗(yàn)飼料。根據(jù)飼料配方(見表1)準(zhǔn)確稱取已粉碎過60目篩的飼料原料，在V型立式混合機(jī)(JS14S型)中與微量組分預(yù)混合10 min后，倒入攪拌機(jī)并逐次加入魚油、磷脂和適量的水，混合15 min后經(jīng)雙螺桿擠條機(jī)(F-75型)擠壓成直徑為3 mm的條狀飼料。在室內(nèi)自然風(fēng)干至飼料水分將至10%左右，將各組飼料進(jìn)行破碎分裝，-20 ℃冰箱保存供養(yǎng)殖試驗(yàn)用。

表1 飼料配方及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))[15]

在廣東海洋大學(xué)海洋生物研究基地(東海島，湛江)實(shí)施石斑魚的養(yǎng)殖試驗(yàn)。將購回的試驗(yàn)用珍珠龍膽幼魚(東海島石斑魚苗場，湛江，廣東)置于室外水泥池中暫養(yǎng)10 d，期間投喂石斑魚商業(yè)配合飼料(粗蛋白≥49%，粗脂肪≥8%)。待石斑魚穩(wěn)定并適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境后，挑選健康且規(guī)格均一的試驗(yàn)魚(初重(9.00±0.49)g)隨機(jī)分配到室內(nèi)海水養(yǎng)殖玻璃鋼桶中。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)3個處理組，每個處理組3個重復(fù)，每個重復(fù)放養(yǎng)30尾魚，靜水養(yǎng)殖8周，定時換水2/3。每天在8:00和17：00進(jìn)行投喂，投喂量約為其體重的3%，定時觀察石斑魚攝食情況及時調(diào)整投喂量，同時記錄死亡數(shù)[15]。

養(yǎng)殖期間用水為經(jīng)過沉淀和沙濾的天然海水，水體中鐵元素含量≤0.000 67 mg/L，24 h供應(yīng)氧氣，溶解氧≥5 mg/L，鹽度27～29，水溫(29.14±0.75)℃，氨氮≤0.03 mg/L。

1.2 樣本采集與處理

8周末，養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束，禁飼24 h后稱重，記錄每個重復(fù)存活尾數(shù)，分別用于計(jì)算各處理組的增重率(WGR)、特定生長率(SGR)和成活率(SR)。分別在每個玻璃鋼桶中隨機(jī)取3尾魚，測量體長和體質(zhì)量后置于-20 ℃冰箱，備測全魚常規(guī)養(yǎng)分和Fe、銅(Cu)、錳(Mn)和鋅(Zn)含量；另取4尾魚分離肝臟并稱重后迅速放于液氮中，后移至-80 ℃保存?zhèn)錅y抗氧化酶活性，同時剝離脊椎骨保存于-20 ℃，備測Fe、Cu、Mn和Zn含量；每重復(fù)取2尾魚分離腸道，并標(biāo)記前、中和后腸固定于10%甲醛溶液中，用于腸道石蠟切片的制作。

1.3 檢測方法

1.3.1 肝臟抗氧化酶活性 測定肝臟中丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)和堿性磷酸酶(AKP)的活性(南京建成生物工程研究所)，樣本前處理和操作過程參考說明書。

1.3.2 礦物元素含量 準(zhǔn)確稱量養(yǎng)殖水體、實(shí)驗(yàn)飼料、全魚和脊椎骨樣品(0.10～0.15 g)于消解罐中，滴加8 mL默克硝酸和2 mL雙氧水后放入微波消解儀(CEM MARS)消解。趕酸后轉(zhuǎn)入比色管中用超純水定容。等離子體質(zhì)譜儀(ICP 6000)測定樣品中Cu、Fe、Mn和Zn四種元素的含量[15]。

1.3.3 腸道石蠟切片 將固定好的珍珠龍膽石斑魚前、中、后腸樣本分別進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為6 μm，蘇木精-伊紅(HE)染色，在全自動生物顯微鏡(DM600)下觀察、拍照并測量腸道樣本的皺襞高度(PH)、皺襞寬度(PW)和肌層厚度(MT)，每張切片分別測定10個相應(yīng)數(shù)據(jù)[15]。

1.4 計(jì)算方法[15]

成活率(Survival rate, SR, %)=100×Nt/N0；

飼料系數(shù)(Feed coefficient rate, FCR)=Wf/(Wt-W0)；

增重率(Weight gain rate, WGR, %)=100×(Wt-W0)/W0；

特定生長率(Special growth rate, SGR, %/d)=100×(lnWt-lnW0)/t；

臟體比(Viscerosomatic index, VSI, %)= 100×Wv/Wt；

肝體比(Hepatosomatic index, HSI, %)=100×WL/Wt；

式中：Nt為終末尾數(shù)；N0為初始尾數(shù)；Wt為終末體質(zhì)量(g)；W0為初始體質(zhì)量(g)；t為試驗(yàn)天數(shù)(d)；Wf為攝入飼料干重(g)；WL為肝臟質(zhì)量(g)；Wv為內(nèi)臟團(tuán)質(zhì)量(g)；Lt為終末體長(cm)。

1.5 數(shù)據(jù)分析[15]

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，通過SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素分析，當(dāng)處理間有顯著差異(P<0.05)時，用 Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。

2 結(jié)果分析

2.1 鐵源對珍珠龍膽石斑魚幼魚生長性能和形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響

3種鐵源對珍珠龍膽石斑魚SR、WGR和SGR均無顯著影響(P>0.05)；Fe-MHA組的FCR顯著高于FeSO4組(P<0.05)。FeSO4組HIS和VSI顯著高于2個添加氨基酸螯合態(tài)Fe源組(P<0.05)，其中Fe-Gly(II)組的HSI和VSI顯著高于Fe-MHA組(P<0.05)。Fe-Gly(II)組和Fe-MHA組的CF顯著高于FeSO4組(P<0.05)，F(xiàn)e-MHA組CF顯著高于Fe-Gly(II)組(P<0.05)(見表2)。

表2 鐵源對珍珠龍膽石斑魚幼魚生長性能及體形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響

2.2 鐵源對珍珠龍膽石斑魚幼魚魚體和脊椎骨礦物元素含量的影響

Fe-MHA組全魚Fe和Zn含量顯著高于FeSO4和Fe-Gly(II)組(P<0.05)；FeSO4組全魚Cu含量顯著高于有機(jī)鐵源組(P<0.05)，且這兩個有機(jī)鐵源組間無顯著差異(P>0.05)；鐵源對珍珠龍膽石斑魚全魚Mn含量沒有顯著性影響(P>0.05)(見表3)。

表3 鐵源對珍珠龍膽石斑魚幼魚全魚Fe、Zn、Cu和Mn含量的影響

FeSO4組幼魚脊椎骨Cu含量顯著高于其余2個Fe的氨基酸螯合物組(P<0.05)；Fe-MHA組石斑魚脊椎骨中Fe含量顯著高于其他2組(P<0.05)；Fe-Gly(II)組Mn含量顯著低于FeSO4組和Fe-MHA組(P<0.05)，且FeSO4組和Fe-MHA組這2組間無顯著差異(P>0.05)；Fe-MHA組Zn含量顯著高于Fe-Gly(II)組和FeSO4組(P<0.05)，而后2組間無顯著差異(P>0.05)(見表4)。

表4 鐵源對珍珠龍膽石斑魚幼魚脊椎骨Fe、Zn、Cu和Mn含量的影響

2.3 鐵源對珍珠龍膽石斑魚幼魚肝臟抗氧化能力的影響

如表5所示，F(xiàn)e-Gly(II)組和FeSO4組肝臟CAT活性無顯著差異，但是，顯著低于Fe-MHA組(P<0.05)。Fe-MHA組肝臟AKP活性顯著低于Fe-Gly(II)組(P<0.05)。Fe-MHA組肝臟MDA含量顯著低于其余2組(P<0.05)。Fe-Gly(II)和Fe-MHA組對肝臟T-SOD活性無顯著影響(P>0.05)，但是這2組的T-SOD活性顯著高于FeSO4組(P<0.05)。

表5 三種鐵源對珍珠龍膽石斑魚幼魚肝臟抗氧化酶活性的影響

2.4 鐵源對珍珠龍膽石斑魚幼魚腸道結(jié)構(gòu)的影響

如表6所示，F(xiàn)e-MHA組石斑魚3個腸段PH顯著高于FeSO4組和Fe-Gly(II)組(P<0.05)。Fe-Gly(II)組和FeSO4組前、中、后腸PW均顯著高于Fe-MHA組(P<0.05)。Fe-Gly(II)組前腸和后腸MT顯著高于Fe-MHA組和FeSO4組(P<0.05)；Fe-MHA組中腸MT顯著高于Fe-Gly(II)組和FeSO4組(P<0.05)。腸道切片顯示(見圖1～3)，有機(jī)鐵源組石斑魚中腸的杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著多于無機(jī)FeSO4組。

表6 鐵源對珍珠龍膽石斑魚幼魚腸道形態(tài)的影響

(綠色雙向箭頭：皺襞高度；黑色雙向箭頭：皺襞寬度；黃色雙向箭頭：肌層厚度。a: FeSO4組；b: Fe-Gly(II)組；c: Fe-MHA組，下同。Green two-way arrows: plica height; Black two-way arrow: plica width;Yellow two-way arrow: muscle thickness.a: FeSO4 group; b: Fe-Gly(group II); c: MHA-Fe group.The same below.)

(白色箭頭表示杯狀細(xì)胞。White arrow represent goblet cells.)

圖3 鐵源對珍珠龍膽幼魚后腸發(fā)育的影響(HE染色，10×)

3 討論

3.1 三種鐵源對珍珠龍膽石斑魚幼魚生長性能和形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響

金屬離子只有在腸道內(nèi)與蛋白質(zhì)或氨基酸結(jié)合形成絡(luò)合物，才能通過富含陰離子的細(xì)胞膜，被機(jī)體吸收利用。并且，該絡(luò)合物的形成需要動物體內(nèi)輔酶的參與，在吸收進(jìn)入血液后與某些蛋白結(jié)合被運(yùn)輸?shù)剿杞M織才能發(fā)揮其功效[15]。金屬離子在魚的堿性中腸環(huán)境下溶解度較低，降低了消化吸收率，而礦物質(zhì)的氨基酸螯合物可直接被吸收[10,16]。當(dāng)微量元素與氨基酸以螯合物的形式進(jìn)入機(jī)體后，則以胞飲的方式被吸收，這樣不但減弱了礦物元素之間的競爭，提高了吸收效率，還改善了其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)攝食氨基酸螯合態(tài)鐵后增重率、蛋白質(zhì)效率以及飼料系數(shù)均優(yōu)于七水合硫酸亞鐵組[17]，這與軍曹魚[18]和奧尼羅非魚(Oreochromisaureus×O.niloticus)[19]的研究結(jié)果類似。添加Fe、Cu、Mn和Zn復(fù)合的氨基酸螯合物與其無機(jī)鹽相比，可以改善青魚(Mylopharyngodonpiceus)[20]和尼羅羅非魚(Oreochromisspp)[21]的生長，提高非特異性免疫力，表明相比無機(jī)微量元素，魚類能夠更有效地利用礦物元素的氨基酸螯合物提高機(jī)體的生長性能。并且，氨基酸的分子量亦會影響微量元素的吸收。氨基酸螯合礦物鹽Fe-MHA和Fe-Gly在動物體內(nèi)的生物利用度較FeSO4高的原因可能是由于氨基酸的分子量和氨基酸的需要程度。甘氨酸的分子量在所有氨基酸中最小，而依據(jù)飼料原料的使用，蛋氨酸成為魚類的第一限制性氨基酸。氨基酸分子量的大小有利于維持其與礦物元素螯合結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并且可以減少消化道內(nèi)其他相關(guān)抑制因子的干擾，從而有利于微量元素的吸收[22]。

循環(huán)養(yǎng)殖的水體礦物質(zhì)濃度會對魚體組織的礦物質(zhì)沉積產(chǎn)生一定影響[23]，本實(shí)驗(yàn)會定期換水，并且通過定期采樣抽查發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖用水體中的Fe元素含量較低，并且各重復(fù)玻璃鋼桶中水體Fe含量無顯著差異，對本實(shí)驗(yàn)中礦物元素有效利用不會造成顯著影響。盡管3種鐵源對石斑魚的生長性能在統(tǒng)計(jì)學(xué)未產(chǎn)生顯著影響，但是石斑魚攝食含有Fe-MHA的飼料，對魚體的形態(tài)學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)有顯著改善，HIS和VSI豆顯著低于無機(jī)組，CF顯著高于無機(jī)組，表明Fe-MHA比FeSO4更能改善珍珠龍膽石斑魚的生長。有研究表明，相比FeSO4，蛋氨酸螯合鐵更有效地參與大鼠肝臟脂肪酸和類固醇的合成，上調(diào)電子呼吸鏈途徑中電子傳遞復(fù)合體Ⅰ、細(xì)胞色素C氧化酶及ATP合成相關(guān)基因表達(dá)，下調(diào)氨基酸分解和尿素循環(huán)途徑中的關(guān)鍵酶基因表達(dá)，表明蛋氨酸螯合鐵有利于降低機(jī)體氨基酸分解產(chǎn)氨，促使能量更有效地參與動物的生長和合成代謝[24]，更有效地促進(jìn)機(jī)體的生長發(fā)育。

礦物元素的添加形式不同，會導(dǎo)致不同的吸收效率，因此也會影響礦物元素發(fā)揮其生理作用和在機(jī)體內(nèi)的沉積效率。蛋氨酸螯合鹽可有效提高加州鱸(Micropterussalmoides)機(jī)體各組織微量元素的含量[25]。本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)e-MHA組和Fe-Gly(II)組全魚和脊椎骨中Fe和Zn含量顯著高于FeSO4組，其中以Fe-MHA組最高，表明氨基酸鰲合鐵Fe-MHA和Fe-Gly(II)比FeSO4更有利于珍珠龍膽石斑魚對Fe和Zn的沉積。Cu作為造血反應(yīng)的激活劑可催化Fe合成血紅蛋白和生成紅細(xì)胞、參與將Fe2+轉(zhuǎn)化為Fe3+合成轉(zhuǎn)鐵蛋白和參與生成銅藍(lán)蛋白[26]。本實(shí)驗(yàn)中FeSO4組全魚和脊椎骨Cu含量顯著高于Fe-Gly(II)組和Fe-MHA組，可能是由于Fe-MHA和Fe-Gly(II)更有利于Fe的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，加速了Cu的動員而降低了組織Cu的沉積。盡管各處理組全魚Mn含量沒有受到3種鐵源的顯著影響，但是從數(shù)據(jù)上可以看出，各組脊椎骨Mn的含量均為其全魚Mn含量的2.5倍，提示脊椎骨可能是Mn元素沉積的主要場所。

3.2 三種鐵源對珍珠龍膽石斑魚幼魚肝臟抗氧化酶活性的影響

Fe在動物機(jī)體內(nèi)參與血紅蛋白與肌紅蛋白的合成、激活碳水化合物代謝過程的關(guān)鍵酶、直接參與CAT等的合成，是細(xì)胞抗氧化防御體系的重要組成部分[27]。Fe2+非?；钴S，容易被氧化為Fe3+，而氨基酸鰲合鐵由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能更好地避免這種氧化反應(yīng)[28]。相比無機(jī)鐵，F(xiàn)e-Gly(II)和Fe-MHA具有較低的氧化性，增強(qiáng)了機(jī)體的抗氧化能力。

與FeSO4相比，軍曹魚[4]、豬[6]和肉仔雞[8]攝食含有蛋氨酸鐵和甘氨酸螯合鐵的飼料可提高血清CAT活性，本實(shí)驗(yàn)中相比于FeSO4和Fe-Gly，添加Fe-MHA顯著提高了肝臟CAT活性。氨基酸螯合鐵具有較高的生物活性也體現(xiàn)在其較強(qiáng)地清除自由基的能力方面[11]。除CAT外，體內(nèi)自由基的動態(tài)變化及組織損傷情況亦可通過SOD的活性得到體現(xiàn)[21]。珍珠龍膽石斑魚肝臟SOD的活性在其攝食氨基酸螯合鐵Fe-Gly(II)或者Fe-MHA后得到顯著改善。機(jī)體對氨基酸螯合鐵吸收效率高，提高了血紅蛋白、肌紅蛋白以及細(xì)胞色素等物質(zhì)的生物活性，有利于調(diào)節(jié)呼吸、氧化應(yīng)激以及電子轉(zhuǎn)移，進(jìn)而提高了鐵的利用率，同時，SOD的活性有賴于Cu、Mn和Zn的參與，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果亦表明氨基酸螯合Fe有利于機(jī)體對這幾種元素的吸收利用，從而使石斑魚肝臟SOD活性的增強(qiáng)。AKP活性表示吞噬細(xì)胞清除異物的能力，是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，同時與一些營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力有關(guān)[29]。Fe-Gly(II)組珍珠龍膽石斑魚肝臟AKP活性較高，表明氨基酸螯合鐵有利于提高魚體吞噬細(xì)胞清除外源有害物質(zhì)的能力。本實(shí)驗(yàn)中石斑魚攝食Fe-MHA后肝臟MDA含量顯著低于其余兩組，更加印證了氨基酸Fe螯合物具有可以增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶活性和清除自由基的能力的生物活性。

此外，氨基酸鰲合鐵改善細(xì)胞防御機(jī)制，促進(jìn)機(jī)體對炎癥的自然反應(yīng)，提高機(jī)體免疫反應(yīng)[30]的結(jié)果也可能是通過對腸道粘膜發(fā)育及物理屏障的改善產(chǎn)生的影響。

3.3 三種鐵源對珍珠龍膽石斑魚幼魚腸道形態(tài)的影響

珍珠龍膽石斑魚幼魚攝食Fe-MHA后顯著提高了前、中、后腸的PH，腸道褶皺數(shù)量增多，皺襞相對完整，排列整齊，提示飼料中添加Fe-MHA有利于提高石斑魚腸道吸收營養(yǎng)物質(zhì)的表面積。由平滑肌組成腸道的肌肉層，其節(jié)律性舒縮是腸道運(yùn)動的主要動力，環(huán)肌通過波狀收縮實(shí)現(xiàn)腸蠕動，推動食糜向后移動[36]，MT的增加能夠提高腸道運(yùn)動的能力。珍珠龍膽石斑魚攝食Fe-Gly(II)或Fe-MHA可一定程度地改善腸道MT，促進(jìn)腸道蠕動，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。杯狀細(xì)胞主要分泌黏液和消化酶，發(fā)揮著潤滑、免疫和幫助消化的作用，因此，杯狀細(xì)胞的數(shù)量可間接反映魚類的消化能力[37]。通過HE染色的切片中可看出，石斑魚攝食Fe-MHA或Fe-Gly(II)后，中腸皺襞杯狀細(xì)胞的數(shù)量明顯多于FeSO4組，表明有機(jī)螯合Fe可通過增加杯狀細(xì)胞的數(shù)量來減少腸道黏膜損傷維護(hù)腸道屏障功能，具有改善免疫和提高消化能力的作用。

4 結(jié)語

相比于無機(jī)態(tài)的FeSO4，珍珠龍膽石斑魚幼魚飼料中添加Fe-Gly(II)或Fe-MHA，對魚體形態(tài)學(xué)和微量元素的沉積產(chǎn)生有益的影響，增加了前腸和中腸的肌層厚度，提高了后腸的皺襞高度，有利于維護(hù)養(yǎng)殖期魚類腸道健康。并且，F(xiàn)e-MHA提高了肝臟的過氧化氫酶和總超氧化物歧化酶活性，降低了丙二醛含量，使幼魚的抗氧化能力得到提升，有利于石斑魚健康生長。推薦珍珠龍膽石斑魚幼魚飼料中添加的鐵源形式為Fe-MHA。