張 丹，涂 紋，劉 群，程鎮(zhèn)燕**，崔 培，王慶奎，喬秀亭

(1.天津農(nóng)學(xué)院天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2.天津市動物疫病預(yù)防控制中心，天津 300000)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)俗稱南美白對蝦，是世界范圍內(nèi)最具經(jīng)濟(jì)價值的蝦類養(yǎng)殖品種之一，具有生長速度快、適應(yīng)能力強等優(yōu)點[1]，其可生存的鹽度范圍為0.5～45[2]。與海水環(huán)境相比，內(nèi)陸淡水的離子比例失衡，部分離子缺乏甚至嚴(yán)重缺乏，因此在內(nèi)陸淡水對蝦養(yǎng)殖區(qū)，需要調(diào)節(jié)水體離子濃度及比例以滿足對蝦生長的需要[3-4]。在不同的養(yǎng)殖環(huán)境中如池塘和河口等，水體離子濃度會因氣候和季節(jié)的變化受到影響，換水也會導(dǎo)致水體離子濃度的波動[5]。研究表明，水體中Ca2+、Mg2+的含量與對蝦的蛻皮、生長和生理代謝聯(lián)系緊密[6-9]。在淡水中，Ca2+、Mg2+等離子含量較低，凡納濱對蝦難以通過主動調(diào)節(jié)吸收足夠的 Ca2+、Mg2+維持正常的生理功能，從而影響其生長，只有水體中 Ca2+、Mg2+濃度在凡納濱對蝦生長的適合范圍內(nèi)，對蝦正常的生理功能得以維持[10-11]。因此，了解咸淡水中凡納濱對蝦在周期性Ca2+、Mg2+濃度波動條件下生長的變化，對指導(dǎo)內(nèi)陸地區(qū)對蝦養(yǎng)殖具有重要意義。

能量代謝組學(xué)作為代謝組學(xué)的一個分支，可對三羧酸循環(huán)、糖酵解途徑和氧化磷酸化過程中的重要代謝物進(jìn)行系統(tǒng)研究。具有高特異性的選擇性反應(yīng)/多反應(yīng)監(jiān)測(SRM/MRM)技術(shù)，不僅能夠進(jìn)行針對性檢測與分析，并可獲得能量代謝物的相對定量結(jié)果。本研究采用SRM/MRM技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，對周期性Ca2+、Mg2+濃度波動的低鹽水養(yǎng)殖的凡納濱對蝦鰓中能量代謝物質(zhì)進(jìn)行分析，為闡明離子濃度變化對凡納濱對蝦生長的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗蝦來源和管理

實驗于2017年7—9月于天津農(nóng)學(xué)院天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室進(jìn)行。實驗用凡納濱對蝦苗(2 cm左右)購自天津市寶坻區(qū)漁翁水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司(水體鹽度2～3)，對蝦運回實驗室后，暫養(yǎng)于室內(nèi)玻璃鋼水槽中。暫養(yǎng)期間水溫(24.0±1.0)℃，光照周期14L∶10D，連續(xù)充氣。每天7:00、14:00和21:00定時投喂人工配合飼料，每次投喂2 h后除去糞便并收集殘餌，殘餌于60 ℃烘干稱重。每天換水1/2以保持良好水質(zhì)，暫養(yǎng)7 d后挑選體色透明、健康活潑的個體用于實驗。

1.2 實驗設(shè)計

實驗用水鹽度為2～3，基礎(chǔ)離子濃度見表1。實驗過程中，Ca2+/Mg2+保持在1∶3左右。以恒定Ca2+濃度150 mg/L、Mg2+濃度450 mg/L為對照組(CC0組)；以4 d為波動周期，通過添加分析純CaCl2、MgCl2或換水的方式調(diào)節(jié)實驗用水的Ca2+、Mg2+濃度，水體離子濃度分別波動至Ca2+濃度100 mg/L、Mg2+濃度300 mg/L(CCM1組)和Ca2+濃度45 mg/L、Mg2+濃度135 mg/L為處理組(CCM2組)，4 d后恢復(fù)為Ca2+濃度150 mg/L、Mg2+濃度450 mg/L，4 d后再進(jìn)行波動，依此類推。每組設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)10尾對蝦。實驗在室內(nèi)玻璃水族箱(50 cm×40 cm×30 cm)中進(jìn)行，實驗周期為30 d。實驗期間的水溫、光照周期和投喂管理與暫養(yǎng)相同。每天統(tǒng)計發(fā)生蛻皮的對蝦數(shù)目。

表1 實驗用水的主要離子濃度

1.3 樣品采集

實驗結(jié)束時，實驗對蝦停止投喂24 h后進(jìn)行樣品采集。樣品采集時，將對蝦放于冰盤上迅速解剖，取其鰓組織，放入1.5 mL 離心管(Axygen, RNase free)中，立即置于液氮環(huán)境中速凍，而后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存待測。

1.4 基于SRM/MRM技術(shù)的能量代謝物分析

1.4.1 樣品處理 每份樣本稱取約55 mg，加入200 μL超純水MP勻漿，加入800 μL預(yù)冷甲醇/乙腈(1∶1，v/v)，渦旋混勻，低溫超聲30 min，-20 ℃孵育1 h沉淀蛋白，11 574 r/min 4 ℃離心20 min，取上清，真空干燥。質(zhì)譜檢測時加入100 μL乙腈-水溶液(1∶1, v/v)復(fù)溶，11 574 r/min 4 ℃離心15 min，取上清，進(jìn)樣分析。

1.4.2 色譜-質(zhì)譜分析

(1)高效液相色譜條件。樣品采用Agilent 1290 Infi-nity LC超高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動相：A液為15 mmol/L乙酸銨水溶液，B液為乙腈。樣品置于4 ℃自動進(jìn)樣器中，柱溫45 ℃，流速為300 μL/min，進(jìn)樣量4 μL。相關(guān)液相梯度如下：0～18.0 min，B 液從90%線性變化到40%；18.0～18.1 min，B液從40%線性變化至90%；18.1～23.0 min，B液維持在90%。樣本隊列中每間隔一定數(shù)量的實驗樣本設(shè)置一個QC樣本，用于檢測和評價系統(tǒng)的穩(wěn)定性及重復(fù)性；樣本隊列的設(shè)置能量代謝物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品混合物，用于色譜保留時間的矯正。

(2)質(zhì)譜分析。采用5500 QTRAP質(zhì)譜儀(AB SCIEX)在負(fù)離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。5500 QTRAP ESI 源條件如下：source temperature 450 ℃，ion Source Gas1(Gas1)：45，Ion Source Gas2(Gas2)：45，Curtain gas(CUR)：30，ion Sapary Voltage Floating(ISVF)-4500 V；采用MRM模式檢測待測離子對。

1.5 數(shù)據(jù)計算與分析

相對增重率(WG，%)=100(Wt-W0)/W0；

蛻皮率(MF，%·d-1)=100Nm/(Ns×T)；

特定生長率(SGR，%·d-1)=100(lnWt-lnW0)/T；

攝食率(FI，%·d-1)=100F/[T×(Wt+W0)/2]；

食物轉(zhuǎn)化效率(FCE，%)=100(Wt-W0)/F2。

式中：Wt，W0是結(jié)束和初始時對蝦的濕重；T為實驗持續(xù)的時間；F為攝食量(干重)，Nm為蛻皮次數(shù)，Ns為每箱養(yǎng)蝦數(shù)。

實驗中，實驗各數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S.E.)表示。利用SPSS 20.0軟件對凡納濱對蝦生長數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析(ANOVA)和Duncan多重比較分析，以P<0.05作為差異顯著水平。采用Multiquant軟件提取色譜峰面積及保留時間。采用能量代謝物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品矯正保留時間，進(jìn)行代謝物鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 周期性Ca2+、Mg2+濃度波動對凡納濱對蝦存活、攝食和生長的影響

周期性Ca2+、Mg2+濃度波動條件下凡納濱對蝦存活、攝食和生長如表2所示，各組均有個體出現(xiàn)死亡，但各組存活率間無顯著性差異(P>0.05)。

從表2中可以看出，3組對蝦FI差異不顯著(P>0.05)。各組間FCE差異均達(dá)到顯著水平，表現(xiàn)為CCM1>CC0>CCM2(P<0.05)。

表2 周期性Ca2+、Mg2+濃度波動下凡納濱對蝦存活、攝食和生長(n=10)

實驗結(jié)束時，各組對蝦WG和SGR差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)，按大小排序為：CCM1>CC0>CCM2。

2.2 周期性Ca2+、Mg2+濃度波動對凡納濱對蝦鰓中能量代謝物質(zhì)的影響

采用SRM/MRM技術(shù)，有針對性地選擇能量代謝物質(zhì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)譜信號采集，對符合規(guī)則的離子對進(jìn)行信號記錄，去除不符合規(guī)則離子信號的干擾。在定量分析過程中，篩選目標(biāo)代謝物特異性的母離子，然后選擇性地對這些母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)，去除其他離子的干擾，只對選定的MS/MS2離子進(jìn)行質(zhì)譜信號的采集，最終檢測出周期性Ca2+、Mg2+濃度波動對凡納濱對蝦有重要作用的21種能量代謝物(見表3)。

表3 周期性Ca2+、Mg2+濃度波動下凡納濱對蝦鰓中能量代謝物質(zhì)表達(dá)量分析

隨著養(yǎng)殖水體Ca2+、Mg2+濃度的周期性變化，凡納濱對蝦體內(nèi)的能量代謝物質(zhì)含量也發(fā)生改變。圖1中，熱圖中不同的顏色代表不同的能量代謝物質(zhì)含量水平: 紅色表示能量代謝物質(zhì)含量相對高，綠色表示能量代謝物質(zhì)含量相對低。為了更直觀地表示各個能量代謝物質(zhì)的含量變化，利用歸一化面積進(jìn)行箱式圖分析(見圖2)。在檢測出的21種能量代謝物質(zhì)中，丙酮酸等3種和草酰乙酸等4種能量代謝物含量隨水體Ca2+、Mg2+濃度波動幅度的升高而降低，分別在CC0組和CCM1組達(dá)到最高；而NAD+等14種能量代謝物含量隨水體Ca2+、Mg2+濃度波動幅度的升高而升高。

(橫坐標(biāo)依次為 CC0、CCM1和CCM2組，每組取各尾對蝦的平均值；縱坐標(biāo)為能量代謝物質(zhì)。The horizontal coordinates was the samples divided into three groups(CC0、CCM1 and CCM2), each group adopted the mean value of the shrimp; vertical coordinates was the energy metabolites.)

(分圖按順序代表的能量代謝物質(zhì)分別為：烏頭酸、ADP、α-酮戊二酸、AMP、檸檬酸、環(huán)腺苷酸、二羥丙酮磷酸、果糖-6-磷酸、黃素單核苷酸、延胡索酸、葡萄糖-6-磷酸、鳥苷酸、乳酸、蘋果酸、NAD+、NADH、NADP+、草酰乙酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、琥珀酸。橫坐標(biāo)依次為 CC0、CCM1和CCM2組；縱坐標(biāo)為歸一化強度。The energy metabolites represented by the sub-graphs in sequence are as follows: aconitate、ADP、alpha-ketoglutaric acid、AMP、citrate、cyclic-AMP、DHAP、F6P、FMN、fumarate、G6P、GMP、lactate、malate、NAD+、NADH、NADP+、oxaloacetate、phosphoenolpyuvate、pyruvate、succinate.The horizontal coordinates was the samples divided into three groups(CC0、CCM1 and CCM2); vertical coordinates was the normalized intensity.)

3 討論

隨著內(nèi)陸對蝦養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，水中離子濃度的變化對對蝦生長存活影響的研究就越來越受重視。Ca2+、Mg2+對于動物生理作用具有相互關(guān)聯(lián)性，研究發(fā)現(xiàn)，水中Ca2+/Mg2+比值為1∶3時，凡納濱對蝦的生長和存活情況較好[12]。此外，適宜的節(jié)律性地添加鈣能促進(jìn)對蝦的蛻皮和生長[13]。本研究模仿自然環(huán)境中養(yǎng)殖水體離子濃度的周期性變化，設(shè)置水中Ca2+/Mg2+比值約為1∶3，但Ca2+、Mg2+濃度波動幅度不同，實驗結(jié)果表明，各組對蝦的存活率、蛻皮率未出現(xiàn)顯著差異，然而，不同Ca2+、Mg2+濃度波動幅度對凡納濱對蝦的生長產(chǎn)生了顯著的影響，其中，Ca2+、Mg2+濃度在適宜范圍內(nèi)波動(CCM1組)，對蝦FCE最高，生長最好。

能量流動伴隨動物體內(nèi)物質(zhì)循環(huán)的進(jìn)行，是機體代謝的核心。當(dāng)環(huán)境條件發(fā)生變化時，動物機體會產(chǎn)生適應(yīng)性生理響應(yīng)，而體內(nèi)充足的能量供給是完成這些生理活動的基礎(chǔ)。因此，能量平衡是動物對變化環(huán)境耐受性的重要衡量指標(biāo)之一[14-15]。已有研究表明，動物在等滲環(huán)境下用于滲透調(diào)節(jié)的能量消耗最少，此時用于生長的能量比例較低滲和高滲條件下更高，因而更有利于生長[16-17]。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)，一些甲殼動物，如Farfantepenaeusbrasiliensis和Penaeusescultentus在非等滲環(huán)境下生長更好[18-19]。這些研究結(jié)果表明，在不同離子濃度的水體環(huán)境中，動物體內(nèi)能量的分配直接影響其生長水平，但機體內(nèi)能量代謝的適應(yīng)性調(diào)節(jié)能力可能存在物種差異。在生物體內(nèi)，能量主要產(chǎn)生于三條途徑：糖酵解、三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))和氧化磷酸化作用，本研究檢測了周期性Ca2+、Mg2+濃度變化條件下凡納濱對蝦稚蝦鰓組織中能量代謝主要途徑中的關(guān)鍵物質(zhì)的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛻皮和生長較好的CCM1組和恒定Ca2+、Mg2+濃度的CC0組對蝦鰓中能量代謝物質(zhì)含量較低，而Ca2+、Mg2+濃度波動幅度較大的CCM2組對蝦鰓中能量代謝物質(zhì)含量普遍較高，推測CC2組對蝦需要更多的能量用于滲透調(diào)節(jié)，從而重新建立體內(nèi)能量平衡，導(dǎo)致對蝦生長速度較慢。

4 結(jié)語

凡納濱對蝦稚蝦在適宜的Ca2+、Mg2+濃度波動范圍內(nèi)(CCM1組)，蛻皮最快，生長最好。利用SRM/MRM技術(shù)，共檢測獲得21種能量代謝物質(zhì)，其中NADP+、環(huán)腺苷酸、丙酮酸和α-酮戊二酸的含量隨Ca2+、Mg2+濃度波動幅度的變化達(dá)到顯著差異。周期性Ca2+、Mg2+濃度波動條件下，凡納濱對蝦具有生長差異，且表現(xiàn)為能量代謝過程的積極響應(yīng)。