崔麗敏，趙麗娜，王玉華

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010110)

額力根是由西紅花、石榴、寒制紅石膏、天竺黃、漏蘆花、肉豆蔻、梔子等二十五味蒙藥材組成的復(fù)方制劑。具有清“血”熱、清“協(xié)日”熱等功效，用于血熱引起的各種肝熱、乙型肝炎、肝腹疼痛等癥。梔子是方中主要藥味之一。梔子[1-4]中含有環(huán)烯醚萜類、二萜類、三萜類、黃酮類、有機酸酯類、揮發(fā)油類和多糖類等化合物[5-7]。梔子苷是梔子的主要指標(biāo)性成分之一[8-9]。本文以高效液相色譜法測定額力根中梔子苷的含量并對制劑中梔子苷的含量限度進行了研究。

1 儀器與材料

島津CTO-10AS型高效液相色譜儀(日本島津)；Heal Force NW15UV型超純水系統(tǒng)；Mettler-Toledo MS105DU型百萬分之一電子天平和Mettler-Toledo XPR10型萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

額力根樣品(批號1806111、1806112、806113)由巴彥淖爾市蒙醫(yī)醫(yī)院提供，自制樣品(批號20190909)。

梔子苷對照品(批號110749-201617),購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，甲醇等試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Alltima C18(250mm×4.6mm,5μm)；流動相：乙腈-水(15∶85)，流速：1.0mL/min；柱溫箱：33℃；注入體積：10μL；測定波長：238nm。

2.2 配制對照品溶液

取梔子苷對照品，加入甲醇配制成每1mL含30μg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 配制供試品溶液

取額力根粉末約0.7g，精密稱定，置錐形瓶中，準(zhǔn)確加入甲醇25mL，稱定樣品，溶劑及瓶的重量，超聲提取30分鐘后，放冷，用甲醇補足提取過程中的溶劑的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，再用0.45μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.4 配制陰性對照溶液

取按處方比例，配制的不含梔子藥材的陰性供試品，配制陰性對照溶液，即得。

2.5 專屬性試驗

精密吸取陰性對照，供試品和對照品溶液各10μL，注入色譜儀中，記錄色譜圖。見圖1。

在同一保留時間8.807min處，供試品在梔子苷色譜圖相同保留時間處有相同梔子苷吸收峰；而陰性對照在梔子苷相同保留時間處無吸收峰。實驗結(jié)果表明此方法專屬性良好。

2.6 線性關(guān)系的考察

梔子苷對照品加入甲醇使溶解并制成濃度為30μg/mL的對照品溶液，吸取1、3、5、7、10、12、15、20μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，梔子苷注入量(X)為橫坐標(biāo)，進行回歸分析。結(jié)果梔子苷在0.03-0.60μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系(r=0.9996)，回歸方程為Y=0.5045X+0.0699。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8h注入液相色譜儀，記錄峰面積，考察溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果在不同時間點測得梔子苷峰面積的RSD為1.99%，供試品溶液在8h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 精密度試驗

取同一供試品溶液，連續(xù)注入6次，記錄梔子苷峰面積積分值。結(jié)果梔子苷峰面積的RSD為0.37%，液相色譜儀精密度良好。

2.9 重復(fù)性試驗

取同一供試品6份，配制成供試品溶液，注入10μl，記錄色譜圖，計算含量。6份樣品梔子苷的平均含量為1.48mg/g，RSD為0.36%。方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收試驗

取已知含量供試品9份，每份約0.35g，精密稱定，分別每份加入一定量的梔子苷對照品溶液，配制成供試品溶液，注入10μl，記錄色譜圖，計算回收率。見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

表1中的數(shù)據(jù)顯示，平均加樣回收率為93.98%(n=9)，RSD為1.86%，本方法準(zhǔn)確度較好。

2.11 樣品測定

取樣品以及自制樣品各約0.7g，精密稱定配制成供試品溶液，注入10μl，記錄色譜圖，以外標(biāo)法計算梔子苷含量。見表2。

表2 樣品中梔子苷含量測定結(jié)果

表2的數(shù)據(jù)顯示，醫(yī)院提供的三批樣品含量約為1.4mg/g，研究者自制樣品的含量為2.7mg/g。這說明梔子藥材的質(zhì)量，對成品中梔子苷的含量影響較大。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

取梔子苷對照品溶液在200～600nm波長處進行光譜掃描，結(jié)果梔子苷在波長238nm處有最大吸收，與《中國藥典》2015年版一部“梔子”項下有關(guān)規(guī)定[10]一致，故選擇238nm作為檢測波長。

3.2 流動相的篩選

本試驗考察了一定比例的甲醇-水、乙腈-水作為流動相的測定，經(jīng)比較認(rèn)為甲醇-水作為流動相時存在分離效果不好、峰形差的問題。以乙腈-水(15∶85)作為流動相時，供試品中梔子苷與其他組分能達到較好的分離，色譜峰具有較好分離度和對稱性，重現(xiàn)性好且基線穩(wěn)定,故最終選擇流動相為乙腈-水(15∶85)。

3.3 提取時間的選擇

在供試品粉碎粒度一致，提取溶劑為甲醇的條件下，考察了超聲提取20分鐘、30分鐘和40分鐘對提取效率的影響，結(jié)果超聲處理30min后，采用本方法測定梔子苷的含量基本不再增加，故確定超聲提取時間為30min。

3.4 含量限度的制定

本次實驗采用HPLC法對供試品及梔子藥材進行測定，結(jié)果梔子苷的平均轉(zhuǎn)移率為80.88%，根據(jù)《中國藥典》2015年版一部“梔子”項下有關(guān)規(guī)定[10]，梔子苷含量限度不得少于1.8%，考慮不同產(chǎn)地梔子藥材和生產(chǎn)過程的粉碎時造成損失量不同，經(jīng)計算含量下浮20%，確定本品每1g含梔子苷不得少于0.43mg。

高效液相色譜法作為額力根中梔子苷含量的檢測方法，實驗結(jié)果重復(fù)性良好，供試品溶液在實驗過程中穩(wěn)定性好，此方法為今后額力根的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了數(shù)據(jù)參考。