周伊寧，劉宇航，劉衛(wèi)東，于海泉

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，呼和浩特 010100；2.大唐藥業(yè)股份公司，呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙藥新藥研發(fā)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010010)

木豆葉為豆科植物木豆Cajanuscajan(L.)Millsp.的干燥葉，夏、秋二季采收，除去枝梗及雜質(zhì)，曬干。木豆別名觀音豆、樹(shù)豆、三葉豆、野黃豆、山豆根[1]。為世界第六大食用豆類(lèi)，也是唯一的木本食用豆類(lèi)。主要分布于東南亞、印度、緬甸及我國(guó)云南、四川、江蘇、廣東、廣西和海南等地[2]。木豆葉脂溶性成分主要含芪類(lèi)及黃酮類(lèi)化合物[3]，其中，木豆葉提取物中芪類(lèi)化合物是一類(lèi)具有廣泛藥用價(jià)值的藥物，具有廣泛的藥理作用，如抗骨質(zhì)疏松、降血糖、降血脂、膽固醇[4]等，其藥效和一線用藥相當(dāng)，而且毒副作用小[2]。

現(xiàn)有木豆葉未列入《中國(guó)藥典》，僅列入《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2004年[1]，但標(biāo)準(zhǔn)很低，未有含量測(cè)定項(xiàng)?，F(xiàn)有木豆葉含量研究有佟美鴻[5]的高效液相色譜法測(cè)定木豆黃酮類(lèi)物質(zhì)中牡荊苷、異牡荊苷和葒草苷。鄭菲艷等[6]的木豆葉總黃酮含量測(cè)定方法。張俊清等[7]的木豆葉中牡荊苷、異美五針?biāo)呻p氫黃酮和木豆芪同時(shí)測(cè)定的高效液相色譜法?？子餥8]的首次建立高效液相方法測(cè)定木豆葉中木豆素。王惠娟等[9]的木豆葉中木豆多糖測(cè)定方法。張俊清等[10]對(duì)木豆葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了深入研究。上述文獻(xiàn)均未見(jiàn)單獨(dú)測(cè)定木豆葉中芪類(lèi)總量的研究報(bào)告。因?yàn)槟径谷~作為抗骨質(zhì)疏松的中藥材，有明確報(bào)道木豆素這類(lèi)芪類(lèi)物質(zhì)發(fā)揮主要作用[11,12]，而本課題是通過(guò)建立芪類(lèi)化合物總量測(cè)定方法，對(duì)木豆葉提取純化工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)報(bào)道芪類(lèi)化合物的分子中都含有1,2-二苯乙烯的基本骨架[3]，318nm的吸收是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)上兩個(gè)苯環(huán)通過(guò)雙鍵連接起來(lái)的長(zhǎng)共軛體系的產(chǎn)生，是其特征波長(zhǎng)[13]。所以，采用白藜蘆醇作為對(duì)照品進(jìn)行，通過(guò)測(cè)定木豆葉提取物中紫外吸收，建立測(cè)定芪類(lèi)化合物總量方法。

1 儀器與藥材

紫外分光光度儀(UV-2450，島津公司)；萬(wàn)分之一天平(瑞士梅特勒天平公司，型號(hào)XPR10)；超聲波恒溫清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司,SBL-22DT,600W,40KHz)白藜蘆醇對(duì)照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：wkq19022201,純度≥98%)；木豆葉藥材(安國(guó)市義通中藥材有限公司)，木豆葉藥材提取物(內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司自制)；乙醇(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)開(kāi)發(fā)公司)為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)定白藜蘆醇對(duì)照品適量，用乙醇溶解，配成12.8μg/ml，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取木豆葉提取物0.10g，精密稱(chēng)定，置25ml量瓶中，加適量乙醇溶解，超聲(20℃、90%)20min，用乙醇定容至刻度，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取2.1和2.2項(xiàng)下對(duì)照品和供試品溶液，在200～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可見(jiàn),在紫外區(qū)內(nèi),白藜蘆醇的最大吸收波長(zhǎng)為320nm，木豆葉提取物芪類(lèi)化合物最大吸收波長(zhǎng)為318nm。從圖譜上看,木豆葉提取物芪類(lèi)化合物的波峰沒(méi)有白藜蘆醇的波峰尖,經(jīng)過(guò)對(duì)木豆葉提取物芪類(lèi)化合物波峰附近的吸收度進(jìn)行對(duì)比,在318～320nm區(qū)間的吸光度差別不大,差別在0.005～0.002之間。綜合考慮本試驗(yàn)選定320nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

因此,以白藜蘆醇為標(biāo)準(zhǔn)在320nm測(cè)定木豆葉提取物芪類(lèi)化合物含量。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.1項(xiàng)下白藜蘆醇對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、5.5ml，置10ml量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻。以相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，在320nm下測(cè)定吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，白藜蘆醇濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。得y=0.0946x+0.0349，r2=0.9960，見(jiàn)圖2，說(shuō)明白藜蘆醇對(duì)照品濃度在1.300～7.150μg/ml范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.5 精密度考察

精密吸取2.1項(xiàng)下白藜蘆醇對(duì)照品溶液4ml，置10ml容量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻。以相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，在320nm下測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，記錄吸光度值，計(jì)算RSD。結(jié)果表明對(duì)照品溶液吸光度的RSD為0.06%(n=6)，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性考察

取同一批次的木豆葉提取物Ⅱ6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1ml，置100ml量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻。以相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，在320nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中芪類(lèi)化合物的含量及RSD值。結(jié)果表明芪類(lèi)化合物含量為96.13mg/g，RSD值為2.3%，說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性考察

取木豆葉提取物Ⅱ，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液2ml，置100ml量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻。以相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，分別于0、30、60、90、120、150、180min在320nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD。結(jié)果表明供試品吸光度的RSD為1.33%，表明供試品在180min內(nèi)較穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率考察

2.8.1對(duì)照品的配制

精密稱(chēng)取白藜蘆醇對(duì)照品適量，用乙醇溶解配置成13.04μg/ml。

2.8.2供試品的制備

精密稱(chēng)取木豆葉提取物Ⅱ0.10g，置25ml容量瓶中，加適量乙醇溶解，超聲(20℃、90%)20min，乙醇定容至刻度，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.8.3加樣回收率測(cè)定

精密量取2.6項(xiàng)下各供試品溶液0.5ml，置于100ml量瓶中，乙醇定容至刻度，搖勻，在320nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

分別取對(duì)照品溶液15ml和各供試品溶液0.5ml，置于100ml量瓶中，乙醇定容至刻度，搖勻，在320nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。計(jì)算加樣回收率及RSD值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 芪類(lèi)化合物含量測(cè)定加樣回收結(jié)果

由表1可知平均加樣回收率及RSD分別為101.54%和0.73%。

2.9 含量測(cè)定

2.9.1提取物中芪類(lèi)化合物含量測(cè)定

共收集到5批次木豆葉提取物樣品。按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液2ml(木豆葉提取物Ⅱ?yàn)榫芰咳?ml)，置100ml量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻。以相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，在320nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中芪類(lèi)化合物的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 芪類(lèi)化合物的含量測(cè)定結(jié)果

2.9.2木豆葉藥材中芪類(lèi)化合物含量測(cè)定

取木豆葉藥材1.0g，平行2份，精密稱(chēng)定。分別置具塞錐形瓶中，加25ml乙醇溶解，稱(chēng)定重量，超聲(20℃、90%)20min，用乙醇補(bǔ)足失重，濾過(guò)，續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1ml，置100ml容量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻。以相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，在320nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算木豆葉藥材樣品中芪類(lèi)化合物的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 木豆葉藥材中芪類(lèi)化合物含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

芪類(lèi)化合物的分子中都含有1.2-二苯乙烯的基本骨架，其中2個(gè)芳香環(huán)上有不同的取代基，常見(jiàn)的取代基是羥基，據(jù)報(bào)道羥基周?chē)江h(huán)上的H被異戊烯基取代將大大增加該類(lèi)化合物的生理和藥理活性[3]，因此，異戊烯基芪類(lèi)化合物是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。木豆葉具有代表性的芪類(lèi)化合物木豆素、木豆素A、木豆素C，均為具有異戊烯基的芪類(lèi)化合物，其中，木豆葉芪類(lèi)提取物具有廣泛的藥理作用，如抗骨質(zhì)疏松藥理作用等，為本課題的研究重點(diǎn)。

木豆葉提取物為用80%乙醇提取后，再上AB-8大孔樹(shù)脂，用水及不同濃度乙醇洗脫的提取物，如表1，用新建立的方法，可以定量檢測(cè)出提取純化效果。