■匡 娜 朱 瑜 謝小東 覃志彪 施 君 于美玲胡庭俊 韋英益

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei），屬于節(jié)肢動(dòng)物門（Arthropoda）甲殼動(dòng)物亞門（Crustacea）軟甲綱（Malacostraca）十足目（Decapoda）對蝦科（Penaeidae）濱對蝦屬（Litopenaeus），原產(chǎn)地為中南美洲，因此又被稱為“南美白對蝦”[1]。凡納濱對蝦是世界第一養(yǎng)殖蝦類，約占全球?qū)ξr養(yǎng)殖產(chǎn)量70%，占我國對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量80%～90%，目前我國凡納濱對蝦種苗生產(chǎn)量已超過7 000億尾[2]。由于養(yǎng)殖規(guī)?；陌l(fā)展和集約化養(yǎng)殖模式的擴(kuò)大，凡納濱對蝦病害流行日益加劇，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，市場上化學(xué)藥物和抗生素的濫用，不僅導(dǎo)致病原菌耐藥性，還會(huì)對養(yǎng)殖環(huán)境造成污染和破壞，給食品安全帶來巨大的安全隱患。因此，尋求或開發(fā)高效、低毒、純天然的復(fù)方微生態(tài)制劑，是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中亟待解決的問題。

我國中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用較為廣泛，與其他藥物相比，其具有利用率高、預(yù)防效果好、無毒、環(huán)境友好、成本低[3]等特點(diǎn)，因此研發(fā)有效的中草藥來預(yù)防和治療對蝦疾病，促進(jìn)對蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展是近年來的研究熱點(diǎn)。中草藥復(fù)合微生態(tài)制劑作為一種促生長飼料添加劑或藥物，不僅可以避免藥物殘留和耐藥性等問題，還能調(diào)整水體生態(tài)環(huán)境的菌群，顯著提升水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量。有研究報(bào)道，中草藥和益生菌聯(lián)合使用能促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及抗病力等[4-6]。因此，復(fù)合微生態(tài)制劑的研究與開發(fā)在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用中具有良好的前景[7-9]。本試驗(yàn)旨在以辣蓼、甘草、甘露寡糖（MOS）、地衣芽孢桿菌等為主要成分的復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦的生長性能和相關(guān)酶活性的影響研究，探討其作用與效果，以期為中草藥復(fù)合微生態(tài)制劑在對蝦養(yǎng)殖業(yè)中的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

甘草（飲片）和辣蓼（全草），購于廣西玉林中藥市場；甘露寡糖（含量99.2%），購于河南貴之恒食品添加劑有限公司；基礎(chǔ)飼料為海大牌2 號料；恩諾沙星（浙江國邦藥業(yè)有限公司）；益菌多（廣西正格農(nóng)牧科技有限公司）；地衣芽孢桿菌（活菌數(shù)1011個(gè)/g以上，購于山東中科嘉億生物工程有限公司），地衣芽孢桿菌菌種由本實(shí)驗(yàn)室保存；酸性磷酸酶測試盒（ACP）、總抗氧化能力測試盒（T-AOC）、谷胱甘肽測試盒（GSH）、一氧化氮合酶測試盒（iNOS）、酚氧化酶測試盒（PO）均購自南京建成生物工程研究所；左旋多巴（L-DOPA）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

540尾凡納濱對蝦購于廣西防城港市凡納濱對蝦種蝦基地。

1.3 甘蓼復(fù)合制劑的制備

1 g/ml 甘草提取液：稱取30 g 甘草，按照料液比1∶12 加入360 ml 雙蒸水，浸泡半小時(shí)，武火煮沸后調(diào)至文火煎煮1 h。200目紗布過濾水煎液，濾渣再次加入360 ml雙蒸水，重復(fù)前述煎煮步驟，水煎煮共3次。合并濾液，濃縮至30 ml，即得到生藥含量為1 g/ml甘草提取液，放置4 ℃保存。

1 g/ml 辣蓼提取液：將曬干的辣蓼全草粉碎為粗粉備用。參照本實(shí)驗(yàn)室先前研究，稱取30 g 辣蓼粗粉，按照料液比1∶30 加入900 ml 雙蒸水，浸泡半小時(shí)，武火煮沸后調(diào)至文火煎煮1 h。200目紗布過濾水煎液，濾渣再次加入900 ml 雙蒸水，重復(fù)前述煎煮步驟，水煎煮共3 次。合并濾液，濃縮至30 ml，即得到生藥含量為1 g/ml辣蓼提取液，放置4 ℃保存。

甘蓼復(fù)合制劑的組成：2%甘露寡糖、1%辣蓼、0.1%甘草、地衣芽孢桿菌（106cfu/ml）按比例配比制備。

1.4 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)設(shè)置6 個(gè)組即對照組和5 個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)。將凡納濱對蝦放置于200 L 塑料箱內(nèi)，盛水1/2，每組90 尾，經(jīng)暫養(yǎng)穩(wěn)定后，分別投喂添加0.5%、1%、2%的甘蓼復(fù)合微生態(tài)制劑的基礎(chǔ)飼料，空白對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，益生菌組飼喂添加市售產(chǎn)品益菌多的基礎(chǔ)飼料，抗生素組飼喂添加恩諾沙星的基礎(chǔ)飼料。

1.5 飼養(yǎng)管理

定時(shí)投喂（8：00、13：00、18：00），投喂量為蝦體重的5%～8%，根據(jù)攝食情況具體調(diào)整。試驗(yàn)周期為3周，每天清污，兩天換水1 次，換水30%左右，水溫28 ℃，24 h充氧，養(yǎng)殖用水為鹵水配置，鹽度為25.0‰，自然光周期，對蝦適應(yīng)環(huán)境一周后，開始試驗(yàn)。

1.6 樣品采集和檢測指標(biāo)

試驗(yàn)至第14 d 和21 d 對各組蝦進(jìn)行采樣，測定凡納濱對蝦體重、血清酚氧化酶（PO）、肝胰臟相關(guān)酶活性等。

1.6.1 血液采集

抽血前用一次性無菌注射器預(yù)先抽取0.2 ml 預(yù)冷的抗凝劑（100 mmol/l 葡萄糖、30 mmol/l 檸檬酸三鈉、26 mmol/l檸檬酸、510 mmol/l氯化鈉、10 mmol/l乙二胺四乙酸二鈉），酒精消毒后，從腹血竇抽血至1.5 ml 滅菌EP 管內(nèi)，每組抽血完畢后，抗凝劑補(bǔ)足體積至與血液體積比為1∶1，然后1 500 r/min、4 ℃、離心10 min，取上清液低溫（4 ℃）保存待測。

1.6.2 肝臟采集及處理

每尾蝦在無菌環(huán)境下，剖取整個(gè)肝臟，置于無菌離心管（15 ml）加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，冰水浴中研磨，用冷凍離心機(jī)于4 ℃、1 500 r/min離心10 min，吸取上清進(jìn)行分裝，保存在-80 ℃，用于測定相關(guān)酶活性。

1.6.3 生長指標(biāo)測定

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，將試驗(yàn)蝦饑餓24 h 后進(jìn)行采樣，測定每個(gè)養(yǎng)殖箱中試驗(yàn)蝦總質(zhì)量，記錄蝦尾數(shù)，測量所有試驗(yàn)蝦個(gè)體體質(zhì)量，用以計(jì)算增重率、特定生長率指標(biāo)參數(shù)。

增重率(WGR，%)=(Wt-W0)/W0×100

特定生長率(SGR，%/d)=(LnWt-LnW0)/t×100

式中：Wt、W0——分別為終末均重和初始均重（g）；

t——試驗(yàn)天數(shù)（d）。

1.6.4 非特異性免疫指標(biāo)測定

于養(yǎng)殖第14 d與21 d時(shí)分別采樣測定。血清酚氧化酶（PO）測定以左旋多巴（L-dopa）為底物，參照Ashida[10]的方法做適當(dāng)修改后進(jìn)行。室溫下，96 T 板內(nèi)，依次加入100 μl 的磷酸鉀鹽緩沖液（0.1 mol/l，pH 值6）和100 μl 的L-DOPA（0.01 mol/l 水溶液），再加入100 μl血清。28 ℃，測OD490，每2 min測一次，測10次，每分鐘變化0.001為一個(gè)酶活性單位。

總抗氧化能力（T-AOC）、酸性磷酸酶（ACP）活性、一氧化氮合酶（iNOS）活性、谷胱甘肽（GSH）含量均采用試劑盒并嚴(yán)格按照說明書方法測定，以考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示。

2 結(jié)果

2.1 甘蓼復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦生長的影響(見表1)

表1 凡納濱對蝦生長性能

由表1 結(jié)果可知，各試驗(yàn)組凡納濱對蝦在21 d養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，平均體重均有所上升，其中低劑量組的增重率和特定生長率較高。表明，一定濃度的甘蓼復(fù)合微生態(tài)制劑具有促進(jìn)對蝦生長的作用。

2.2 甘蓼復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦相關(guān)酶活性的影響

各試驗(yàn)組凡納濱對蝦在養(yǎng)殖14 d和21 d的免疫酶活性如表2、表3所示。在試驗(yàn)14 d時(shí)，高劑量組和益生菌組對蝦iNOS活性均顯著高于空白組（P＜0.05），試驗(yàn)21 d時(shí)，低劑量組對蝦iNOS活性與空白對照組相比顯著升高（P＜0.05），其余組與空白組相比差異不顯著（P＞0.05），中劑量組、高劑量組、益生菌組和抗生素組對蝦iNOS 活性無顯著差異（P＞0.05），在養(yǎng)殖14 d、21 d時(shí)，中劑量組對蝦T-AOC水平均顯著高于空白對照組（P＜0.05），而益生菌組則顯著低于空白對照組（P＜0.05）。其余各組對蝦T-AOC水平在兩個(gè)時(shí)期與空白組差異均不顯著（P＞0.05）。在養(yǎng)殖14 d、21 d時(shí)，抗生素組對蝦ACP活性顯著低于空白組（P＜0.05），其余各試驗(yàn)組與空白對照組無顯著差異（P＞0.05）。各試驗(yàn)組對蝦GSH水平在養(yǎng)殖14 d與21 d時(shí)，與空白組相比均無顯著差異（P＞0.05）。在養(yǎng)殖14 d時(shí)，各試驗(yàn)組PO活性與空白組相比無顯著差異（P＞0.05），養(yǎng)殖21 d時(shí)，中劑量組對蝦的PO活性顯著高于空白對照組（P＜0.05），其余各組與空白組無顯著差異（P＞0.05）。

表2 甘蓼復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦相關(guān)酶活性的影響（試驗(yàn)14 d）

表3 甘蓼復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦相關(guān)酶活性的影響（試驗(yàn)21 d）

3 討論

3.1 甘蓼復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦生長性能的影響

動(dòng)物的生長受自身因素和外周因素影響，自身因素如種類、發(fā)育階段和生理狀態(tài)等，外在因素主要為環(huán)境因素，水生動(dòng)物對環(huán)境因素變化更為敏感[11]。本研究在凡納濱對蝦的基礎(chǔ)飼料中添加不同劑量的甘蓼復(fù)合微生態(tài)制劑，均能促進(jìn)凡納濱對蝦的平均體重，其中添加0.5%甘蓼復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦的生長最有利。結(jié)果與郭慧等[9]在飼料中添加濃度為0.2%的水解單寧對凡納濱對蝦的研究結(jié)果相似，其增重率、特定增長率和肥滿度與0.1%添加組相比均有下降趨勢。

3.2 甘蓼復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦相關(guān)酶活性的影響

凡納濱對蝦為低等甲殼動(dòng)物，其主要通過非特異性免疫系統(tǒng)起防御作用。對蝦體液免疫系統(tǒng)包括酚氧化酶原激活系統(tǒng)、活性氧和活性氮生成系統(tǒng)等。PO是反映機(jī)體抗氧化、氧化機(jī)體有害物質(zhì)能力的酶，在對蝦免疫系統(tǒng)中具有重要作用[12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)飼喂21 d 添加1%甘蓼復(fù)合制劑能顯著提高凡納濱對蝦血液中PO活性。李軍濤等[13]研究發(fā)現(xiàn)隨著杜仲葉提取物添加量的增加，對蝦血清PO 活性呈先增加后降低的變化趨勢，以0.3 g/kg組的PO活性最高，達(dá)3.77 U/mg。ACP是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，能夠水解病原菌細(xì)胞表面的磷酸酯，從而發(fā)揮免疫功能[14]。本試驗(yàn)中，連續(xù)21 d在飼料中添加0.5%甘蓼復(fù)合制劑使對蝦血液中ACP活性高于同期空白組，且各試驗(yàn)組ACP 活性在試驗(yàn)后期高于前期，這與王明華等[15]、郝凱[16]的研究趨勢是一致的。

總抗氧化能力（T-AOC）常被用于綜合評價(jià)機(jī)體總抗氧化系統(tǒng)功能狀態(tài)。本試驗(yàn)中添加1%甘蓼復(fù)合制劑，連續(xù)飼喂21 d，對蝦肝胰腺內(nèi)T-AOC 水平顯著高于同期空白對照組。胡俊茹等[17]研究發(fā)現(xiàn)黑水虻幼蟲粉替代飼料中15%～20%的魚粉可顯著增強(qiáng)凡納濱對蝦幼蝦血清中抗氧化酶的活性，進(jìn)而提高機(jī)體的抗氧化能力。GSH 是水生無脊椎動(dòng)物體內(nèi)重要的非酶性抗氧化物，在機(jī)體清除氧自由基時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。但本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)飼料中添加試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)的甘蓼復(fù)合制劑，不會(huì)抑制對蝦機(jī)體通過GSH 發(fā)揮抗氧化的作用。其原因可能與諸多因素有關(guān)，袁宏利等[19]發(fā)現(xiàn)氨氮脅迫會(huì)誘導(dǎo)黃河鯉幼魚肝組織中還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量升高，影響水生動(dòng)物體內(nèi)的GSH含量變化。在養(yǎng)殖前期，基礎(chǔ)飼料中添加2%甘蓼復(fù)合制劑顯著提高對蝦的iNOS活性，但在養(yǎng)殖后期，添加0.5%甘蓼復(fù)合制劑能顯著提高對蝦的iNOS活性。也許是因?yàn)樵陲曫B(yǎng)早期階段，甘蓼復(fù)合制劑的有效成分在對蝦體內(nèi)積累較少，故添加量較高的試驗(yàn)組表現(xiàn)出較明顯的免疫效果。隨著飼養(yǎng)時(shí)間的增長，添加量較少的試驗(yàn)組其有效成分在對蝦體內(nèi)積累到一定量時(shí)，發(fā)揮出明顯促進(jìn)效果，而添加量較高的試驗(yàn)組由于對蝦體內(nèi)過多的有效成分反而起抑制效果，其免疫性能相對于添加量少的組有所下降。

益生菌、益生元與中草藥的復(fù)配應(yīng)用因具有促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及抗病力等功效，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。湯菊芬等[20]將中草藥與益生菌復(fù)配使用，有效提高了吉富羅非魚的生長性能及抗病力。文國樑等[21]、于明超等[22]的研究顯示，芽孢桿菌作為益生菌與中草藥復(fù)配作為飼料添加劑，可有效提高南美白對蝦的免疫相關(guān)酶活性，且效果優(yōu)于單一使用組。本研究發(fā)現(xiàn)甘蓼復(fù)合制劑對南美白對蝦各免疫指標(biāo)具有不同程度的積極作用且效果在部分免疫指標(biāo)方面優(yōu)于同期使用抗生素、市售益生菌組。甘蓼復(fù)合制劑在養(yǎng)殖的不同時(shí)間階段作用也有所不同，這可能是由于其成分種類多，包括寡糖、兩味中草藥以及地衣芽孢桿菌。

4 小結(jié)

飼料中添加適量甘蓼復(fù)合微生態(tài)制劑能提高凡納濱對蝦的生長性能，增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫功能，對其抗病力具有積極作用，該研究結(jié)果能夠?yàn)榉布{濱對蝦健康生態(tài)養(yǎng)殖的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，并具有重要的意義。