曲 浩，劉 悅，孫云南，尚衛(wèi)瓊，田易萍，陳林波

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，云南省茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南勐海666201）

紫娟茶樹（Camellia sinensiscv.Zijuan）具有紫色新梢、紫色嫩葉等特征，其中含有大量花青素，具有很好的保健作用[1]。但是紫娟茶樹在不同區(qū)域種植會(huì)發(fā)生新梢、嫩葉變綠現(xiàn)象，從而影響茶葉的品質(zhì)[2]。紫娟芽葉色澤呈現(xiàn)紫色和高含量花青素是評(píng)價(jià)其茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)[2]，紫娟葉片發(fā)育成熟后顏色由紫變綠，原因可能是由于花青素等內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生了變化；有研究表明，結(jié)構(gòu)基因決定花青素苷的種類，而調(diào)控基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子決定結(jié)構(gòu)基因表達(dá)與否及強(qiáng)弱，影響花青素合成的量[3-4]。

目前，已從紫葡萄、紫紅薯、越橘等植物中分離克隆了大量與花青素合成代謝相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控基因[5-7]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子功能涉及黃酮類生物合成、花器官形成及表皮細(xì)胞的形成[8-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，蘋果中bHLH蛋白MdbHLH3和MdbHLH33是R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子，MdMYB10有效誘導(dǎo)花青素合成蛋白依賴于MdbHLH3和MdbHLH33的共同表達(dá)[11]；在玉米中，bHLH蛋白與MYB轉(zhuǎn)錄因子C1、PL1協(xié)作參與調(diào)控花青素合成信號(hào)通路[12]。MYC1基因是bHLH家族中的重要成員，目前的研究表明，MYC1基因在葡萄中參與類黃酮類化合物的調(diào)控[8]。此外，MYC1基因參與了花青素的調(diào)節(jié)與原花青素的生物合成，能夠與不同的MYB轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控花青素合成信號(hào)通路[13]。

本研究基于前期對紫娟茶樹的轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)了MYC1基因在葉片中的表達(dá)差異，對MYC1基因進(jìn)行克隆得到其完整序列，采用生物信息學(xué)軟件對19個(gè)MYC1同源基因進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建，并對紫娟MYC1與葡萄vvMYC1氨基酸序列進(jìn)行比對分析；此外，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對不同光質(zhì)照射下及不同空間生長的紫娟葉片中MYC1基因進(jìn)行檢測，以明確MYC1基因的生物學(xué)功能和表達(dá)特性，為進(jìn)一步研究MYC1基因?qū)ㄇ嗨睾铣傻恼{(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料選用云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所培育的紫娟茶樹葉片?；蚩寺≡囼?yàn)材料選取第二葉進(jìn)行；不同光質(zhì)照射實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析選取第二葉為材料；基因空間表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析選取芽、第二葉、開面葉、成熟葉為材料。采集的樣品于-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 紫娟茶樹MYC1基因的克隆 根據(jù)獲得的MYC1基因片段序列信息，采用DNAstar軟件設(shè)計(jì)引物；采用RACE方法對MYC1基因片段3′端和5′端進(jìn)行克隆，拼接驗(yàn)證后獲得全長cDNA。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 在NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上完成核苷酸和蛋白序列比對分析；用Protparam工具進(jìn)行基因編碼蛋白理化性質(zhì)分析；采用SignalP預(yù)測氨基酸序列信號(hào)肽；采用ProtScale進(jìn)行親水性分析；采用ProtCompv.9.0進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；采用MEGA7軟件進(jìn)行MYC1相關(guān)基因進(jìn)化樹的構(gòu)建；利用SWISS-MoDEL預(yù)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 用自然光、綠光、藍(lán)光、黃光、紫光分別處理紫娟茶樹，并采集芽、第二葉、開面葉、成熟葉，采用植物總RNA抽提純化試劑盒提取RNA，以反轉(zhuǎn)錄后所得的cDNA為模板，GAPDH作為內(nèi)參基因，采用SYBR法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。GAPDH所用引物序列為GAPDH-F：5′-GATAGTGTTCACGGTCAATGGA-3′和 GAPDH-R：5′-TATCCTTATCAGTGAAGACACC AGT-3′；MYC1所用引物為 MYC1-F1：5′-TCTTTC CCTCCTGGTGTTGG-3′和 MYC1-R1：5′-GCACTCT TGGCGAGAATAGCT-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 MYC1基因的克隆

以紫娟茶樹葉片的基因組DNA為模板，克隆獲得紫娟茶樹MYC1基因的全長為2 576 bp，其中，A堿基657個(gè)，占25.5%；G堿基677個(gè)，占26.28%；C堿基653個(gè)，占25.35%；T堿基589個(gè)，占22.86%。研究還發(fā)現(xiàn)，常見的酶切位點(diǎn)222個(gè)，另外，MYC1基因包含一個(gè)2 307 bp的完整開放閱讀框（ORF），編碼768個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)理論分子量為85.26 ku，理論等電點(diǎn)為4.63；預(yù)測分子式為C3752H5938N1062O1180S23，原子總數(shù)為11 955，脂溶系數(shù)78，不穩(wěn)定系數(shù)66.44，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)（圖1）。

2.2 MYC1基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 進(jìn)化樹分析 選取15個(gè)不同物種MYC1和3個(gè)茶樹bHLH家族基因的核苷酸序列與紫娟MYC1的核苷酸序列進(jìn)行同源比對分析，并利用MEGA7軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果表明，它們都屬于IIIf亞類，紫娟茶樹MYC1與葡萄vvMYC1、茶樹bHLH1、茶樹MYC2以及番茄SIMYC1具有較高的同源性（圖 2）。

2.2.2 蛋白疏水性分析及信號(hào)肽預(yù)測 將推測的氨基酸序列導(dǎo)入ProtScale工具進(jìn)行蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的親/疏水性預(yù)測，結(jié)果表明，最高正值2.911出現(xiàn)在第713位氨基酸，疏水性最強(qiáng)；最小負(fù)值-3.5出現(xiàn)在第305—313位氨基酸，親水性最強(qiáng)（圖3-A）；其平均疏水性系數(shù)為-0.519，MYC1屬于不穩(wěn)定親水蛋白質(zhì)（負(fù)值為親水、正值為疏水）。信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果顯示（圖3-B），信號(hào)肽預(yù)測值為0.010 3，其他預(yù)測值為0.989 7，因此，MYC1蛋白不含有信號(hào)肽，沒有信號(hào)識(shí)別功能，為非分泌蛋白。

2.2.3 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測 蛋白亞細(xì)胞預(yù)測分析結(jié)果顯示，蛋白定位的整體預(yù)測中細(xì)胞核得分為9.97，說明該蛋白大概率定位在細(xì)胞核（表1）。

表1 MYC1蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

2.2.4 氨基酸序列比對 將推導(dǎo)出的茶樹MYC1的氨基酸序列與葡萄vvMYC1、茶樹bHLH1的氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，它們的序列具有一定的相似性，MYC1、vvMYC1和bHLH1的氨基酸序列在N端都含有一個(gè)保守的MYB互作區(qū)域。此外，在MYC1和vvMYC1氨基酸序列MYB互作區(qū)域的N端發(fā)現(xiàn)了一個(gè)富含酸性氨基酸的序列，該序列包含29個(gè)酸性氨基酸（圖4）。這個(gè)MYB互作區(qū)域通常被認(rèn)為是反激活域，它形成了一個(gè)蛋白結(jié)合表面，與RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄[14]。

2.2.5 蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SWISS-MODEL構(gòu)建紫娟茶樹MYC1蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型（圖5-A），MYC1蛋白三維結(jié)構(gòu)與模板結(jié)構(gòu)相似度為32.78%；圖5-B中，深色為完全允許區(qū)域，散點(diǎn)大多集中在深色區(qū)域，表明MYC1蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果較為可靠。

2.3 MYC1基因表達(dá)分析

2.3.1MYC1基因在紫娟茶樹葉片中的時(shí)空表達(dá)分析 采集紫娟茶樹芽、第二葉、開面葉、成熟葉分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測MYC1基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明，第二葉中MYC1基因表達(dá)量最高，是芽中MYC1基因表達(dá)量的2.2倍；開面葉中MYC1基因的表達(dá)量低于第二葉，是芽中的1.8倍；成熟葉中MYC1基因表達(dá)量最低，為芽中的0.56倍（圖 6）。

2.3.2MYC1基因在不同光質(zhì)下的表達(dá) 將紫娟茶樹分別放置在室溫下，在自然光、紫光、綠光、藍(lán)光、黃光照射下培養(yǎng)，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測MYC1基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明，在不同光質(zhì)照射下，自然光下MYC1基因表達(dá)量最高，黃光下MYC1基因表達(dá)量最低，其他光質(zhì)下MYC1基因表達(dá)量大小順序?yàn)樽瞎猓揪G光＞藍(lán)光（圖7）。

3 結(jié)論與討論

本研究獲取了紫娟茶樹MYC1的全長，選取了15個(gè)物種MYC1和3個(gè)茶樹bHLH家族基因構(gòu)建進(jìn)化樹[14]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們都屬于IIIf亞類，并且與葡萄vvMYC1、番茄SIMYC1具有較高的同源性。前人研究表明，MYC1參與了類黃酮生物合成的調(diào)控。在葡萄中，類黃酮通路基因的調(diào)控依賴于MYB轉(zhuǎn)錄因子與其相互作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，紫娟MYC1與葡萄vvMYC1氨基酸序列在N端都含有一個(gè)保守的MYB互作區(qū)域，表明紫娟MYC1基因可能同樣參與類黃酮生物合成的調(diào)控，并且發(fā)揮著與葡萄vvMYC1基因相同的作用。

花青素是一類廣泛存在于植物中的類黃酮化合物，對調(diào)節(jié)葉片顏色起著重要的作用[16]。已有研究表明，紫娟茶樹葉片花青素含量由高到低分別為第二葉、開面葉、芽、成熟葉[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，MYC1基因在紫娟葉片中的表達(dá)量由高到低同樣為第二葉、開面葉、芽、成熟葉。說明在紫娟茶樹中，MYC1基因可能參與調(diào)節(jié)花青素的生物合成。此外，前人研究還表明[17-18]，不同光質(zhì)的照射能夠?qū)Σ铇浠ㄇ嗨睾吭斐捎绊憽Ｔ谔O果中，光誘導(dǎo)MYB基因表達(dá)調(diào)控紅蘋果花青素的生物合成[19]。本試驗(yàn)表明，在黃、綠、藍(lán)、紫這4種光質(zhì)照射下，紫光中MYC1表達(dá)量最高，說明不同光質(zhì)對MYC1基因表達(dá)造成了一定影響。推測光質(zhì)通過對MYC1基因的應(yīng)答來調(diào)控花青素的含量，從而調(diào)節(jié)葉片顏色，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。基于上述分析，初步推測MYC1基因參與了紫娟茶樹花青素的生物合成，并且紫娟MYC1基因的表達(dá)與光質(zhì)有關(guān)。