王海燕，賈衛(wèi)軍，張春輝，張衛(wèi)憲，向瑞平

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省非常規(guī)飼料資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046)

十二指腸賈第蟲(G.duodenalis)是重要的人獸共患腸道寄生蟲，其包囊廣泛存在于動(dòng)物糞便和環(huán)境中，常通過糞便造成傳播和感染，家畜是人類感染十二指腸賈第蟲的主要傳染源[1]。宿主感染十二指腸賈第蟲后，因宿主免疫狀態(tài)不同而出現(xiàn)不同的臨床癥狀，免疫功能低下者多表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、腹痛等癥狀，嚴(yán)重時(shí)死亡，而免疫功能正常者常呈隱性感染，不表現(xiàn)出臨床癥狀[2]。十二指腸賈第蟲分為8個(gè)(A～H)集聚體，其中集聚體A和B是主要的人獸共患集聚體，集聚體C～H具有宿主特異性，集聚體C和D主要感染犬科動(dòng)物，集聚體E、集聚體F、集聚體G和集聚體H分別主要感染偶蹄動(dòng)物、貓科動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物和海豹[3]。

奶牛是十二指腸賈第蟲的重要保蟲宿主。感染奶牛的十二指腸賈第蟲集聚體主要有集聚體A、B和E，以集聚體E為優(yōu)勢(shì)感染集聚體[4-8]，但在我國青海省牦牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)集聚體B為優(yōu)勢(shì)感染集聚體[9]。為了解鄭州市郊規(guī)模化奶牛場十二指腸賈第蟲的感染情況和集聚體分布情況，本研究對(duì)鄭州市郊兩個(gè)規(guī)模化場奶牛十二指腸賈第蟲集聚體進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

于2016年1月至6月，以鄭州市郊區(qū)兩個(gè)規(guī)?；瘓?-6月齡奶牛為對(duì)象，經(jīng)直腸采集糞便樣本363份(養(yǎng)殖場A，190份；養(yǎng)殖場B，173份)，每份30～50 g，分別裝入潔凈的自封袋中，標(biāo)記牛號(hào)、年齡、健康狀況等信息，帶回實(shí)驗(yàn)室，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取

使用E.Z.N.A.? Stool DNA Kit試劑盒(OMEGA生物技術(shù)公司，D4015-02)提取奶牛糞便的全基因組，提取的DNA于-20 ℃凍存。

1.3 PCR擴(kuò)增

采用PCR對(duì)所有奶牛糞便DNA樣本進(jìn)行小亞單位rRNA(SSUrRNA)、磷酸丙糖異構(gòu)酶 (TPI)、谷氨酸脫氫酶 (GDH) 和β-賈第素(BG)基因的擴(kuò)增，引物序列、反應(yīng)條件和目的片段見表1。引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 十二指腸賈第蟲4種基因擴(kuò)增的引物

SSUrRNA基因位點(diǎn)反應(yīng)體系：1 μL DNA (第2輪模板為第1輪PCR產(chǎn)物)，0.3 μL上游引物(20 μmol/L)，0.3 μL下游引物(20 μmol/L)，2 μL dNTPs (2.5 mmol/L)，2.5 μL 10 × Taq buffer，0.15 μL rTaq 酶(5 U/μL)，二甲基亞砜(DMSO)1.25 μL，加超純水至25 μL。TPI和GDH基因位點(diǎn)反應(yīng)體系：1 μL DNA，0.3 μL上游引物(20 μmol/L)，0.3 μL下游引物(20 μmol/L)，2 μL dNTPs (2.5 mmol/L)，2.5 μL 10 × Taq buffer，0.15 μL rTaq 酶(5 U/μL)，加超純水至25 μL。BG基因位點(diǎn)反應(yīng)體系：1 μL DNA，0.3 μL上游引物(20 μmol/L)，0.3 μL下游引物(20 μmol/L)，2 μL dNTPs (2.5 mmol/L)，2.5 μL 10 × Taq buffer，0.15 μL rTaq 酶(5 U/μL)，加超純水至25 μL。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物，與1.5 μL 6×Loading Buffer混合均勻，加入1%瓊脂糖凝膠加樣孔，進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察。選用TaKaRa公司生產(chǎn)的DL 2000 Marker作為參照。

1.4 序列測(cè)定和比對(duì)

委托北京諾賽公司將PCR擴(kuò)增出的目的片段進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序儀型號(hào)為ABI3730XL，測(cè)序試劑盒為Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA)。所獲序列在GenBank上用Blast進(jìn)行同源序列搜索，應(yīng)用Clustal X 2.3.3軟件進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 種系發(fā)育分析

利用Mega 7.01軟件構(gòu)建種系進(jìn)化樹 (http://www.megasoftware.net)，采用鄰接法，選用模型為Kimura 2-parameter，用bootstrap對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行可靠性分析，1000個(gè)重復(fù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用χ2檢驗(yàn)比較不同養(yǎng)殖場和不同年齡段奶牛十二指腸賈第蟲感染率的差異，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 奶牛十二指腸賈第蟲的感染情況

如表2所示，在363份樣品中共發(fā)現(xiàn)155份樣品十二指腸賈第蟲陽性，總感染率為42.7% (155/363)。養(yǎng)殖場A的感染率為44.2%(84/190)，養(yǎng)殖場B的感染率為41.0%(71/173)，兩場間奶牛十二指腸賈第蟲的感染率差異不顯著(P>0.05)。

斷奶前犢牛(0～60 d)(n=203)和斷奶后犢牛(61～180 d)(n=160)十二指腸賈第蟲的感染率分別為49.2%(100/203)和34.3%(55/160)，不同年齡段犢牛的感染率差異極顯著 (P<0.01)。

表2 鄭州市郊兩個(gè)規(guī)模化場奶牛十二指腸賈第蟲感染情況

2.2 集聚體鑒定

如表3所示，基于4個(gè)基因位點(diǎn)的序列分析，共鑒定出155個(gè)陽性樣本，包括4種集聚體：集聚體E (n=149)、集聚體A (n=3)、集聚體B (n=1)和A/E混合集聚體(n=2)。各個(gè)年齡段和養(yǎng)殖場均以集聚體E為優(yōu)勢(shì)集聚體。養(yǎng)殖場A共發(fā)現(xiàn)4種集聚體，分別為集聚體E、集聚體A、集聚體B和A/E混合集聚體；養(yǎng)殖場B共發(fā)現(xiàn)3種集聚體，分別為集聚體E、集聚體A、和A/E混合集聚體。斷奶前奶牛共發(fā)現(xiàn)4種集聚體，分別為集聚體E、集聚體A、集聚體B和A/E混合集聚體；斷奶后奶牛共發(fā)現(xiàn)3種集聚體，分別為集聚體E、集聚體A和A/E混合集聚體。

表3 十二指腸賈第蟲集聚體分布 個(gè)

2.3 種系發(fā)育分析

117個(gè)SSUrRNA序列共鑒定出2個(gè)集聚體：集聚體E(n=112)和集聚體A(n=5)。集聚體E與集聚體A序列分別與美國牛源分離株(序列號(hào)AY655701)和中國犬源分離株(序列號(hào)KJ027407)有100%同源性。

24個(gè)BG序列分別屬于集聚體E(n=22)和集聚體A(n=2)。集聚體E形成1條序列，與中國奶牛源(序列號(hào)MF671887)分離株有100%同源性。集聚體A則與來自中國臺(tái)灣牛源分離株(序列號(hào)EF061084)有100%同源性(圖1A)。

利用GDH基因位點(diǎn)，共鑒定出2個(gè)集聚體：集聚體E(n=30)和集聚體A(n=2)。集聚體E陽性樣本形成1條序列，與中國河南奶牛源分離株Sq57(序列號(hào)KF843925)有100%同源性。2份集聚體A陽性樣品形成了1條序列，為AI亞集聚體，與中國奶牛源分離株Fy22(序列號(hào)KF843930)有100%同源性(圖1B)。

利用TPI基因位點(diǎn)，共鑒定出3個(gè)集聚體：集聚體E(n=70)、集聚體A(n=2)和集聚體B(n=1)。集聚體E共形成2條不同的序列(E1-E2)，分別與中國奶牛源分離株(序列號(hào)KY769101和KY769102)有100%的同源性，其中E1序列為優(yōu)勢(shì)集聚體(n=58)。2份集聚體A樣品共形成了1條序列，屬于AI亞集聚體，與秘魯羊駝源分離株 (序列號(hào)JX845464) 有100%同源性。集聚體B與中國兔源分離株(序列號(hào)HQ397719)有100%同源性(圖1C)。

圖1 基于BG、GDH和TPI基因鄰接法構(gòu)建的奶牛十二指腸賈第蟲的種系發(fā)育進(jìn)化樹

3 討論

十二指腸賈第蟲病是人獸共患水源性疾病，目前被列為危害人類健康的10 種主要寄生蟲病之一[14]，同時(shí)，家畜、伴侶動(dòng)物和野生動(dòng)物也是十二指腸賈第蟲的常見宿主。近年來發(fā)現(xiàn)，奶牛感染十二指腸賈第蟲普遍，呈世界性分布，在比利時(shí)、美國、加拿大、丹麥、澳大利亞和葡萄牙等地區(qū)均有奶牛感染的報(bào)告[1]。2007年肖淑敏首次從廣東某牛場分離出十二指腸賈第蟲[15]。目前，我國關(guān)于奶牛賈第蟲感染情況的報(bào)道較多，包括黑龍江(5.2%)[16]、河南(3.4%)[17]、廣東(2.2%和74.2%)[6, 7]、寧夏(2.12%)[5]、陜西(18.87%)[18]、青海(10%)[19]、北京(1.7%)[20]、新疆(13.42%)[21]和四川(9.4%)[8]等地區(qū)。本次調(diào)查結(jié)果顯示，河南省鄭州市郊區(qū)兩個(gè)規(guī)?；膛鍪改c賈第蟲總體感染率為 42.7%，高于中國大多數(shù)地區(qū)，但低于上海(60.1%)和廣東地區(qū)(74.2%)[4, 6]。

不同年齡段奶牛十二指腸賈第蟲的感染率存在著較大的差異。本研究顯示斷奶前犢牛的感染率明顯高于斷奶后犢牛，此結(jié)果與Santin等的報(bào)道一致，Santin等的報(bào)道顯示，1周齡至24個(gè)月齡的奶牛均可感染十二指腸賈第蟲，而4～8周齡犢牛的感染率較高[22]。Mark-Carew等[23]也報(bào)道31～60日齡犢牛的感染率較高。但是Huetink等[24]卻發(fā)現(xiàn)0～1月齡犢牛的感染率較低，而4～5月齡奶牛的賈第蟲感染率最高。O'Handley等[25]報(bào)道2～3月齡奶牛的賈第蟲感染率最高。

經(jīng)序列比對(duì)及構(gòu)建進(jìn)化樹分析，本研究檢測(cè)出四種集聚體，包括集聚體E、A、B和A/E混合型，其中集聚體E是優(yōu)勢(shì)感染集聚體，此結(jié)果與中國、比利時(shí)、美國、加拿大、丹麥、澳大利亞和葡萄牙等地區(qū)的報(bào)告一致[1]。十二指腸賈第蟲集聚體A和B 具有廣泛的宿主范圍，屬于人獸共患集聚體。集聚體E一直以來被認(rèn)為是偶蹄家畜的專屬集聚體，但是，近年來，在人、非人靈長類、馬和兔等的糞便樣品中發(fā)現(xiàn)集聚體E[26,27]，同時(shí)，Lebbad 等[28]發(fā)現(xiàn)集聚體E 形成了集聚體A的一個(gè)小分支，上述研究提示集聚體E可能是重要的人獸共患集聚體。本研究結(jié)果表明，鄭州市郊大型規(guī)模化奶牛場奶牛十二指腸賈第蟲的感染率較高，存在人獸共患風(fēng)險(xiǎn)，需引起重視。