侯 博 王晨燕 車勇良 栗紹文 周倫江＊

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013；2.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 武漢 430070）

細菌生物被膜（Bacterial biofilm）是細菌粘附聚集到有生命或無生命固體表面的一種群體性行為，是細菌適應應激環(huán)境（不利環(huán)境）而采取的一種生存策略，具有極強的耐藥性及免疫逃逸性[1]，是造成臨床慢性感染和持續(xù)感染的主要原因之一。 細菌生物被膜不僅造成抗菌藥物在獸醫(yī)臨床上的治療失敗[2]，也影響食品加工過程中的消毒效果，通過食物鏈進入人體，對人類健康同樣有著極大的威脅[3]。 生物被膜存在于農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)、乳品加工業(yè)、魚品加工業(yè)、禽和肉品加工業(yè)以及即食食品加工業(yè)[4]，存在于食品工業(yè)中的生物被膜細菌主要有大腸埃希菌、李斯特菌、空腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌等[5]，可以存在于所有類型食品加工裝置塑料、玻璃、金屬、木頭、食品產(chǎn)品的表面[6-8]，成為影響公共衛(wèi)生安全的重要隱患。因此，控制細菌生物被膜的形成在獸醫(yī)、醫(yī)學、食品等領域均具有極為重要的意義。

毒素-抗毒素系統(tǒng)（Toxin-antitoxin，T-A）最早是在1983 年被發(fā)現(xiàn)，存在于低拷貝質(zhì)粒上[9]，目前發(fā)現(xiàn)T-A 系統(tǒng)普遍存在于細菌和古細菌的染色體上，包括人類和動物的致病菌， 每個系統(tǒng)都有2 個共表達基因組成，其中一個基因編碼毒素蛋白，另一個編碼抗毒素；毒素通常比較穩(wěn)定，抑制細菌生長；而抗毒素不穩(wěn)定， 則可以通過中和毒素， 對細菌起保護作用。 II 型T-A 系統(tǒng)編碼的抗毒素不僅可以通過直接的蛋白-蛋白相互作用中和相應的毒素， 并且可以通過與啟動子區(qū)域的操縱元件結(jié)合調(diào)控T-A 操縱子轉(zhuǎn)錄。 關于T-A 系統(tǒng)對生物被膜形成影響的研究較少， 報道與生物被膜形成具有直接作用的第一個T-A 系統(tǒng)為MqsRA[10-11]，并且對其調(diào)控生物被膜形成的分子機制研究較為深入。 本研究通過缺失腸外致病性大腸埃希菌的毒素-抗毒素系統(tǒng)yafON 基因， 研究yafON 毒素-抗毒素系統(tǒng)缺失對ExPEC 生物被膜形成能力的影響， 為解析毒素-抗毒素系統(tǒng)yafON 調(diào)控生物被膜形成機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 ExPEC 野生菌株PPECC42、大腸桿菌χ7213、 自殺性載體pRE112 均由華中農(nóng)業(yè)大學栗紹文副教授惠贈。 大腸桿菌DH5α 購自北京莊盟生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 試驗所需限制性內(nèi)切酶、高保真聚合酶Premix Prime STAR○RHS(Loading dye mix)、T4-DNA 連接酶購自大連寶生物有限公司（TakaRa）；PCR MIX 和各種DNA marker 購自東盛生物有限公司； 細菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基和蔗糖購自OXOID 公司；試驗所用抗生素購自Amresco 公司；2，6-二氨基庚二酸（DAP）購自Sigma 公司；核酸回收試劑盒購自天根生化 （北京） 有限公司；96 孔培養(yǎng)板購自NUNC公司。

1.3 引物的設計 根據(jù)ExPEC PPECC42 菌株基因組序列信息和重疊PCR （Over-Lapping PCR） 的原理，利用軟件Primer Premier 5.0 設計靶基因缺失的上下游引物以及鑒定引物，其序列見表1，由南京金斯瑞生物有限公司合成。

1.4 缺失菌株的構(gòu)建及鑒定

1.4.1 靶基因上下游同源臂的重疊PCR 擴增 根據(jù)重疊PCR（overlapping-PCR）的原理和方法，使用P1/P2，P3/P4 兩對引物分別對靶基因yafON 的上游片段和下游片段進行擴增，擴增反應體系如下：Premix Prime STAHS 12.5 μL、P1/P2 或P3/P4 各0.5 μL、 模板1 μL、ddH2O 10.5 μL； 擴增反應條件為：98 ℃、10 s，56 ℃、5 s，72 ℃、1 min，共計30 個循環(huán)。將上下游片段的擴增產(chǎn)物分別切膠回收，將回收的產(chǎn)物作為模板，利用重疊PCR 對上下游同源臂進行重疊PCR。以引物P1/P4 為模板進行擴增，擴增體系如下：Premix Prime STARHS 12.5 μL、上游片段回收產(chǎn)物1 μL、 下游片段回收產(chǎn)物1 μL、ddH2O 10.5 μL，先擴增5 個循環(huán)后，再加入引物P1/P4 各1 μL 進行擴增；擴增反應條件為：98 ℃、10 s，56 ℃、5 s，72 ℃、1 min40 s，共計5/28 個循環(huán)。

表1 yafON 雙缺失株構(gòu)建所用引物序列和PCR 產(chǎn)物大小

1.4.2 同源重組供體菌的構(gòu)建 將上述over-lapping PCR 產(chǎn)物進行切膠回收，將回收產(chǎn)物和自殺性載體pRE112 進行Xba I、Sac I 雙酶切，對酶切產(chǎn)物切膠回收后與載體片段連接， 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞χ7213，在含氯霉素（終濃度25 μg/mL）的L-A 平板（含1‰DAP）上挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切鑒定，將鑒定正確的測序驗證。

1.4.3 靶基因缺失株的篩選與鑒定 根據(jù)參考文獻[12]中的方法，將構(gòu)建正確的陽性克隆χ7213 供體菌和野生親本菌株進行接合轉(zhuǎn)移。 將篩選到的氯霉素抗性、蔗糖敏感的接合子接種在無NaCl、無抗性的LB 液體中，37 ℃振蕩培養(yǎng)17～18 h 后，篩選氯霉素敏感、蔗糖抗性的菌落，使用引物P5/P6 進行PCR鑒定，PCR 反應體系：PCR MIX 12.5 μL、P5/P6 各0.5 μL、模板1.5 μL、ddH2O 10 μL ；PCR 反應條件：95 ℃、3 min，95 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30 個循環(huán)，72 ℃、10 min。

1.5 ExPEC 野生菌株與yafON 基因缺失株的生物被膜形成能力比較 根據(jù)參考文獻[13]中的方法修改進行， 將野生菌株、yafON 基因缺失株分別接種LB 培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)物分別用新鮮M9 培養(yǎng)基進行1:100 稀釋，稀釋好的菌液分別加入96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每株細菌分別設8 個重復。 以無菌培養(yǎng)基作空白對照，28 ℃或37 ℃靜置培養(yǎng)24 h 或5 d，將過夜培養(yǎng)物輕輕吸出，用滅菌蒸餾水洗滌微孔三次，晾干，96 孔板中，每孔加1%結(jié)晶紫125 μL 染色15 min，用流水輕輕沖掉染液，輕甩晾干，再每孔加入33%乙酸150 μL，振蕩溶解10 min，置于酶標儀下測定OD630值，運用統(tǒng)計學分析所得數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 ExPEC yafON 基因缺失株的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)同源重組的原理和自殺性質(zhì)粒pRE112 進行缺失株的構(gòu)建。首先擴增yafON 基因的上下游片段，其大小分別為665 bp、690 bp，擴增結(jié)果見圖1。 將擴增的上下游片段純化后采用重疊PCR 的方法擴增同源重組所需基因缺失片段ΔyafON， 其大小為1 330 bp，擴增結(jié)果見圖2。 將重疊PCR 產(chǎn)物的片段回收，與自殺性載體pRE112 同時酶切，純化回收酶切產(chǎn)物，連接后轉(zhuǎn)入χ7213，挑單菌落擴大培養(yǎng)抽提質(zhì)粒進行酶切鑒定， 將酶切條帶位置正確的質(zhì)粒再經(jīng)過測序證實序列缺失正確。

圖1 yafON 基因上下游片段擴增PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 yafON 基因上下游片段重疊PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

接合轉(zhuǎn)移后，經(jīng)兩次篩選，將表型正確的單菌落接種于LB 培養(yǎng)基，擴大培養(yǎng)后，采用引物P5/P6 進行PCR 鑒定，PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定（見圖3），結(jié)果顯示yafON 基因缺失菌株即ExPEC PPECC42-ΔyafON 菌株的PCR 擴增產(chǎn)物大小為277 bp， 對照野生菌株ExPEC PPECC42 的PCR 擴增產(chǎn)物大小為817 bp，與預期結(jié)果一致，初步證實yafON 基因缺失菌株構(gòu)建成功，并且將PCR 產(chǎn)物片段回收純化后測序，證實缺失序列正確。

圖3 鑒定引物P5/P6 擴增缺失菌株及野生菌株的yafON 基因產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 ExPEC yafON 基因缺失對生物被膜形成能力的影響 為探索yafON 在ExPEC 生物被膜形成中的作用， 采用結(jié)晶紫染色法對ExPEC 野生菌株PPECC42 和 yafON 基因缺失菌株ExPEC PPECC42-ΔyafON 的生物被膜形成能力進行測定和比較。結(jié)果顯示在M9 培養(yǎng)基28 ℃條件下培養(yǎng)5 d，野生菌株ExPEC PPECC42 的生物被膜形成能力非常強，為強生物被膜形成菌株，而yafON 基因缺失菌株ExPEC PPECC42-ΔyafON 的生物被膜形成能力極顯著下降（P＜0.01），結(jié)果見圖4。

圖4 缺失菌株與野生菌株生物被膜形成情況

3 分析與討論

腸外致病性大腸埃希菌（Extraintestinal Pathogenic E. coli，ExPEC）是一種重要的病原菌，不僅可以引起人、寵物以及食用動物的腸外感染，比如新生兒腦膜炎、敗血癥、肺炎和乳房炎[14-16]，還是一種重要的食源菌，可通過污染的飲水、食品引起食源性疾病暴發(fā)流行[17-18]；ExPEC 菌株目前在不同的國家廣泛地從零售雞肉、牛肉、豬肉、餐館、即食食品（包括肉類、水果和蔬菜）中分離得到[19-20]，因此，推測肉制品可能是人ExPEC 感染的最重要來源。本研究對豬源ExPEC 的yafON 毒素-抗毒素基因缺失后，與野生株相比，其生物被膜形成能力顯著下降，證實yafON 毒素-抗毒素系統(tǒng)參與了ExPEC 生物被膜形成過程， 在生物被膜形成過程中發(fā)揮了主要作用， 但yafON 在生物被膜形成中的具體作用還不清楚，其發(fā)揮作用的分子機制尚待研究。 毒素-抗毒素系統(tǒng)（Toxin-antitoxin，T-A）廣泛存在于細菌基因組中，在細菌的生理活動中發(fā)揮著重要作用：維持基因組的穩(wěn)定性、促進抗生素壓力下持留細胞的形成、增強噬菌體感染的耐受性、調(diào)控細菌細胞程序性死亡、在細菌致病中發(fā)揮作用， 在本研究中發(fā)現(xiàn)還參與了細菌生物被膜的形成。 因此，T-A 系統(tǒng)成為多重耐藥病原菌致病機理和防控技術研究的新靶標， 可以作為控制ExPEC 乃至多重耐藥細菌感染和生物被膜形成新的潛在的藥物靶標。