袁文靜

河南省周口市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 周口 466000

大柴胡顆粒源于漢代張仲景《金匱要略》中記載的“大柴胡湯”，該方主要有柴胡、大黃、枳實(shí)(炒)、黃芩、芍藥、半夏(姜)、大棗、生姜8味藥組成[1-3]，具有和解少陽、內(nèi)瀉熱結(jié)的功效，現(xiàn)代常用于治療因少陽不和、肝膽濕熱所致的口苦、舌紅苔黃膩、大便秘結(jié)，臨床應(yīng)用較為廣泛[4-5]。目前關(guān)于大柴胡顆粒有效成分的含量測(cè)定報(bào)道少較，藥典中也尚未有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的記載，因此建立完善、系統(tǒng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)大柴胡顆粒安全有效的應(yīng)用于臨床有重要意義。黃芩苷和芍藥苷分別是黃芩和白芍的主要有效成分[6-7]，本研究采用快速、高效的HPLC技術(shù)同時(shí)測(cè)定大柴胡顆粒中芍藥苷和黃芩苷的含量，為建立大柴胡顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-1260高效液相色譜儀，配有G1311C 1260 Quat Pump VL 四元低壓泵，G1316A 1260 Tcc 恒溫箱，G1329B 1260 Als自動(dòng)進(jìn)樣器，G1314F 1260 VWD 型紫外檢測(cè)器，Rev.B.04.03[52]Agilent Chem-station數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(安捷倫科技有限公司)；AE-100電子天平(德國(guó)梅特勒公司)

芍藥苷對(duì)照品，批號(hào)為110736-201741，純度為95.70%，黃芩苷對(duì)照品，批號(hào)為110781-201717，純度為96.9%，均來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；大柴胡顆粒(精華制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)分別為 100103、110801、110802)；蒸餾水(可幫化工有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純(科密歐公司)；磷酸為分析純(西域化學(xué)試劑公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 采用Kromasil 100-5C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)進(jìn)行檢測(cè)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)，采用梯度洗脫的方法，程序?yàn)?～15 min(5%～20% A)，15～28 min(20%～25%A)，28～37 min(25%～25% A)，37～50 min(25%～55% A)，柱溫為30 ℃；流速為0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：采用分段變波長(zhǎng)模式，0～20 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；20～30 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)要求：按黃芩苷計(jì)算不得低于4000，按芍藥苷計(jì)算不得低于3000。

2.2 對(duì)照品及供試品溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對(duì)照品20.08 mg，置于100 mL的容量瓶中，然后加甲醇定容至刻度，超聲溶解混勻，得芍藥苷對(duì)照品的儲(chǔ)備液；精密稱取黃芩苷對(duì)照品45.25 mg，置于50 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲溶解混勻，得黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取芍藥苷、黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于同一容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配置成每1 mL含芍藥苷0.1 mg、含黃芩苷0.4525 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取大柴胡顆粒適量，研細(xì)，精密稱定1.0 g，置于25 mL的容量瓶中，加入10 mL濃度為75%甲醇溶液進(jìn)行溶解，然后超聲處理15 min，此操作重復(fù)處理2次，待溶液放冷后，再加入75%甲醇定容至刻度，搖勻，檢測(cè)前過0.45 μm的微孔濾膜，即得到供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 依照生產(chǎn)廠家大柴胡顆粒原配方比例分別稱取缺白芍、缺黃芩以外的其余藥材，然后按照廠家的生產(chǎn)工藝分別制成缺黃芩、缺白芍的陰性樣品顆粒，隨后按照“2.2.2”項(xiàng)下步驟進(jìn)行操作，制成缺白芍、缺黃芩的陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 陰性干擾實(shí)驗(yàn) 分別取黃芩苷和芍藥苷的混合對(duì)照品溶液、缺白芍陰性對(duì)照溶液、缺黃芩的陰性對(duì)照溶液以及供試品溶液，按照設(shè)定“2.1”項(xiàng)下的色譜條件依次進(jìn)樣分析。結(jié)果在陰性對(duì)照品溶液黃芩苷和芍藥苷色譜峰相應(yīng)位置處無干擾峰出現(xiàn)(如圖1所示)，表明陰性對(duì)照無干擾，該方法專屬性良好。

1.芍藥苷 2.黃芩苷

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下芍藥苷對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20μL，得6份樣品，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件將6份樣品依次進(jìn)樣分析并記錄相應(yīng)的峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以最小二乘法求得芍藥苷回歸方程為：Y=689.72X+15.214(r=0.9999)，表明芍藥苷進(jìn)樣量在 0.1～2.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下黃芩苷對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，得6份樣品，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件將6份樣品依次進(jìn)樣分析并記錄相應(yīng)的峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以最小二乘法求得黃芩苷回歸方程為Y=1275.8X+45.213(r=0.9999)，表明黃芩苷進(jìn)樣量在 0.4525～9.05 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品適量，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件對(duì)同一樣品重復(fù)進(jìn)樣分析6次，計(jì)算芍藥苷、黃芩苷色譜峰峰面積及相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值。得芍藥苷RSD值為0.87%，黃芪苷的RSD值為1.21%，試驗(yàn)結(jié)果表明該儀器精密度良好，可以滿足進(jìn)一步的試驗(yàn)要求。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取相同批號(hào)的大柴胡顆粒(批號(hào)100103)適量，按照“2.2.2”項(xiàng)下的步驟進(jìn)行操作，平行制備6份供試品溶液。取制得的6份供試品溶液，分別按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，隨后分別記錄芍藥苷、黃芪苷的色譜峰峰面積，計(jì)算其RSD值。得芍藥苷RSD值為1.25%，黃芪苷的RSD值為0.98%，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的大柴胡顆粒(批號(hào)100103)適量，按照“2.2.2”項(xiàng)下操作制備供試品溶液。取同一供試品溶液適量，分別在置于室溫下0、2、4、8、12、24h后，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，隨后分別記錄芍藥苷、黃芪苷的色歐風(fēng)峰面積，計(jì)算其RSD值。得芍藥苷RSD值為1.63%，黃芪苷的RSD值為1.21%，試驗(yàn)結(jié)果表明樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)的大柴胡顆粒(批號(hào)100103)適量，研細(xì)，平行稱取6份，每份樣品約0.5 g，隨機(jī)分為3組，每組2份，置于帶塞錐形瓶中，3組樣品分別加入低、中、高三個(gè)濃度的混合對(duì)照品(芍藥苷2.0053 mg/mL，黃芪苷8.2316 mg/mL)0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，然后按照“2.2.2”項(xiàng)下操作步驟制備供試品溶液，取供試品溶液10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下設(shè)定的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，根據(jù)加入量和測(cè)得量計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.3.7 樣品含量測(cè)定 分別稱取3個(gè)批次(100103、110801、110802)的大柴胡顆粒適量，按照“2.2.2”項(xiàng)下操作步驟制備得到供試品溶液。分別取每個(gè)批次的取供試品溶液10μL按照“2.1”項(xiàng)下設(shè)定的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，得各個(gè)批次樣品中芍藥苷、黃芩苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 大柴胡顆粒中芍藥苷、黃芩苷的含量測(cè)定 (mg/g)

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的選擇 黃芩味苦、性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。藥效學(xué)研究表明黃芩中主要的藥效成分為黃酮類化合物黃芩苷，同時(shí)《中國(guó)藥典》中規(guī)定黃芩苷為黃芩飲片質(zhì)量控制的檢測(cè)指標(biāo)，現(xiàn)代藥理研究表明黃芩苷具有顯著的生物活性，用于臨床有保肝利膽、抗菌、抗炎、抗變態(tài)及解痙的藥理作用[8-9]。白芍味苦、酸，性微寒，具有養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛的功效，白芍的主要藥效成分為芍藥苷，也是《中國(guó)藥典》中白芍飲片的質(zhì)量控制指標(biāo)，同時(shí)現(xiàn)代藥理研究表明芍藥苷具有抗炎、解熱、解痙、調(diào)節(jié)免疫的作用[10-11]。因此，本研究選擇黃芩苷和芍藥苷為檢測(cè)指標(biāo)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 根據(jù)有關(guān)報(bào)道[12-15]，本研究曾選擇甲醇-水、甲醇-0.1磷酸、乙腈-0.1%冰醋酸、乙腈-0.05磷酸作為流動(dòng)相，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈較甲醇的基線更平穩(wěn)，黃芩苷在酸性條件下較純水的峰形更尖銳，靈敏度更高，可能原因?yàn)辄S芩苷中含有酚羥基，有弱酸性，在流動(dòng)相中加入少量酸，可有效抑制黃芩苷解離。另外考慮到色譜柱對(duì)酸的耐受性，最終選擇乙腈-0.05%磷酸作為流動(dòng)相。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇 在提取劑選擇方面，以色譜峰的分離效果和吸收強(qiáng)度為考察的指標(biāo)，選取了水、95%乙醇、甲醇為提取溶媒，結(jié)果表明甲醇提取液色譜峰的數(shù)目以及分離度明顯優(yōu)于其他的提取液，因此最終選擇甲醇作為提取溶劑。在提取方式方面，曾嘗試回流提取、超聲提取、索式提取，結(jié)果表明3種方式的提取效率并無太大差別，由于超聲提取更加的便捷、節(jié)省時(shí)間，因此最終選擇甲醇為溶媒，進(jìn)行超聲提取。

4 小結(jié)

本研究建立HPLC法同時(shí)測(cè)定大柴胡顆粒中黃芩苷和芍藥苷的含量的分析方法，并經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，該方法簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好，可作為大柴胡顆粒中芍藥苷、黃芩苷含量測(cè)定的方法，為大柴胡顆粒的質(zhì)量控制提供可參考的檢測(cè)方法。