潘 莉 郭 斌 唐徐韻 尚雪梅 胡蔚婧 楊孝芳

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550002

膝骨性關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis, KOA)是以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的一種慢性關(guān)節(jié)病[1]，臨床表現(xiàn)主要以膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形和功能障礙為主，不僅損害關(guān)節(jié)軟骨，還累及整個(gè)關(guān)節(jié)，是中老年人的常見(jiàn)病、多發(fā)病[2-3]。該病發(fā)病率高，患病人數(shù)逐年增多，西藥起效快，但具有明顯的胃腸道副反應(yīng)，不適宜長(zhǎng)期應(yīng)用，只可短期對(duì)癥治療[4]。近些年中醫(yī)藥在治療骨關(guān)節(jié)疾病和自身免疫性疾病中展現(xiàn)出了良好的療效[5-6]，因此中藥候選藥物備受期待和矚目。

牛膝是臨床治療骨關(guān)節(jié)類(lèi)疾病常用中藥，屬于莧科植物牛膝Achyranthes bidentate BI的根，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、活血通絡(luò)等功效[7]。藥理學(xué)研究表明[8-11]，牛膝具有抗炎、抗骨質(zhì)疏松、免疫調(diào)節(jié)、軟骨修復(fù)等多方面作用，但其治療KOA的主要物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法，從分子水平上闡明牛膝治療KOA的有效成分、作用靶點(diǎn)和關(guān)鍵機(jī)制通路，為后期的基礎(chǔ)研究、新藥開(kāi)發(fā)和臨床研究提供一定的參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 牛膝所含化合物的檢索與篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP)在“Herb name”選項(xiàng)中輸入牛膝，對(duì)牛膝所有化合物進(jìn)行檢索，根據(jù)藥物動(dòng)力學(xué)和成藥原則，設(shè)定口服生物利用度(Oral bioavailability, OB)≥30%和類(lèi)藥性指數(shù)(Drug-like index, DL)≥0.18為篩選條件進(jìn)行篩選。

1.2 牛膝所含化合物作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的Related Targets收集牛膝所含化合物作用的靶點(diǎn)并進(jìn)行整理，通過(guò)Perl軟件篩選有效化合物靶點(diǎn)基因，將所得的基因用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選和映射得到對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.3 KOA疾病靶點(diǎn)及牛膝作用于KOA的靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)以“knee osteoarthritis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，收集 KOA疾病相關(guān)靶點(diǎn)，為增強(qiáng)疾病與靶點(diǎn)的相關(guān)性，將GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出的靶基因按Relevance score≥10進(jìn)行整理，并與OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)所得的靶基因進(jìn)行合并、去重。將牛膝所對(duì)應(yīng)的有效化合物預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)與KOA疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入VENNY 2.1 軟件，獲取牛膝作用于KOA的交集靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò) 將預(yù)測(cè)得到的牛膝有效成分和 KOA效應(yīng)靶點(diǎn)等信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖繪制，應(yīng)用Cytoscape-Tool-Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度和介數(shù)中心度，尋找牛膝治療KOA關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)。

1.5 牛膝對(duì)KOA作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將獲得的牛膝作用于KOA的靶點(diǎn)上傳至在線 STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“Homo sapiens”(人類(lèi))，設(shè)置靶點(diǎn)間最低要求互動(dòng)得分為0.9并隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開(kāi)連接的節(jié)點(diǎn)，獲取相應(yīng)的蛋白相互作用圖，并根據(jù)結(jié)果對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分析。

1.6 牛膝治療KOA的GO功能富集分析和KEGG 通路富集分析 應(yīng)用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在效應(yīng)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。GO功能富集分析選擇生物過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組成(cellular component)和分子功能(molecular function)3個(gè)部分前10條進(jìn)行繪圖，KEGG篩選前20個(gè)條目進(jìn)行氣泡圖繪制。

2 結(jié)果

2.1 牛膝所含化合物篩選結(jié)果 經(jīng)TCMSP共檢索到牛膝含有化合物176個(gè)，根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18篩選后，得到有效活性成分20個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 牛膝有效活性成分

續(xù)表1表1 牛膝有效活性成分

2.2 牛膝有效化合物作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 將篩選出的20個(gè)牛膝有效化合物靶點(diǎn)進(jìn)行整理，通過(guò)perl軟件篩選有效化合物靶點(diǎn)基因，將所得的基因用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選和映射得到363個(gè)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名。

2.3 KOA疾病靶點(diǎn)及牛膝作用于KOA的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 通過(guò)GeneCards檢索收集 KOA疾病相關(guān)的靶點(diǎn)1878個(gè)，篩選Relevance score≥10分的靶點(diǎn)，篩選后剩余靶點(diǎn)201個(gè)；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)所得靶點(diǎn)28個(gè)，匯總后去除重復(fù)共得到KOA相關(guān)疾病靶基因223個(gè)。將牛膝經(jīng)過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選和映射得到363個(gè)靶點(diǎn)與KOA收集到的223個(gè)疾病靶基因?qū)隫ENNY 2.1 軟件，共得到29個(gè)共同靶點(diǎn)(見(jiàn)圖1、表2)。

2.4 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果 應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件將預(yù)測(cè)得到的牛膝有效成分、作用靶點(diǎn)和KOA疾病靶點(diǎn)進(jìn)行藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖繪制(如圖2所示)，并用Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度和介數(shù)中心度，得出化合物槲皮素(quercetin，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=28，介數(shù)中心度=0.3187)，漢黃芩素(wogonin，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=12，介數(shù)中心度=0.0591)，山奈酚(kaempferol，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=10，介數(shù)中心度=0.0377)，黃芩素(baicalein，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=5，介數(shù)中心度=0.0098)為牛膝治療KOA主要化合物；靶點(diǎn)前列腺素G/H合成酶2(PTGS2，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=12，介數(shù)中心度=0.1056)，前列腺素G/H合成酶1(PTGS1，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=11，介數(shù)中心度=0.0883)，一氧化氮合酶2(NOS2，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=7，介數(shù)中心度=0.0297)，雌激素受體1(ESR1，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度=7，介數(shù)中心度=0.0308)，為主要相互作用靶點(diǎn)。

圖1 牛膝作用于KOA的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)圖

表2 牛膝作用于KOA的靶點(diǎn)

2.5 牛膝對(duì)KOA作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 將獲得牛膝作用于KOA的29個(gè)靶點(diǎn)基因上傳至在線STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“Homo sapiens”(人類(lèi))，設(shè)置靶點(diǎn)間最低要求互動(dòng)得分為0.9并隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開(kāi)連接的節(jié)點(diǎn)，獲取相應(yīng)的蛋白相互作用圖如圖3所示，根據(jù)Count值篩選列舉牛膝治療KOA排名前20的關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)果如圖4所示。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果 注：六邊形為中藥牛膝；四邊形為疾病KOA；三角形為牛膝治療KOA主要化合物；橢圓形為主要作用靶點(diǎn)。

圖3 牛膝對(duì)KOA作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 牛膝治療KOA排名前20的關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.6 牛膝治療KOA的GO功能富集分析和 KEGG 通路富集分析結(jié)果 應(yīng)用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在效應(yīng)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology, GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析。GO功能富集分析得出生物過(guò)程條目有1080條，細(xì)胞組成條目有8條，分子功能條目有36條，取每個(gè)部分排名前10的條目進(jìn)行繪圖、分析，不足10條的按實(shí)際富集信息展示，結(jié)果如圖5所示。在生物過(guò)程分析中排名靠前的主要有細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、急性期反應(yīng)等；在細(xì)胞組成分析中排名靠前的主要有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、纖維狀膠原三聚體、帶狀膠原纖維、膠原三聚體復(fù)合物等；在分子功能分析中排名靠前的主要有細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、整聯(lián)蛋白結(jié)合、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合等。KEGG通路富集分析取前20條通路制作氣泡圖如圖6所示。結(jié)果顯示，晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體(AGEs-RAGE)、白介素17(IL-17)、腫瘤壞死因子(TNF)、松弛素(Relaxin)、C-型凝集素(C-type Lectins) 、Toll樣受體(TLR)等信號(hào)通路是牛膝治療KOA主要靶點(diǎn)富集的通路。

圖5 牛膝治療KOA關(guān)鍵靶點(diǎn)GO富集分析

圖6 牛膝治療KOA關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

3 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，痹癥主要是由素體不足，正氣偏虛，勞逸過(guò)度，腠理不密，衛(wèi)外不固，外邪入侵，飲食失調(diào)等所造成，其反復(fù)發(fā)作可使津血運(yùn)行不暢，氣滯血瘀，久則損傷肝腎，造成肝腎虧虛，由此波及其他臟腑。所以活血化瘀和補(bǔ)益肝腎在痹癥的治療中顯得尤為重要，而牛膝的主要功效為補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，逐瘀通經(jīng)。牛膝在很多名方、驗(yàn)方和名老中醫(yī)治療骨關(guān)節(jié)疾病中都有體現(xiàn)[12]，雖然取得了很好的療效，但其具體分子機(jī)制方面的研究相對(duì)較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素(quercetin)，山奈酚(kaempferol)，黃芩素(baicalein)為牛膝治療KOA主要化合物。Bing Wei等[13]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以通過(guò)減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解來(lái)改善骨關(guān)節(jié)的變性。山奈酚可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞中miR-101的上調(diào)和Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，從而影響成骨細(xì)胞的增殖、遷移和分化[14]。黃芩素在體外和體內(nèi)均能夠顯著降低與軟骨炎癥反應(yīng)發(fā)生密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)。此外，黃芩素還能減輕前交叉韌帶橫斷誘發(fā)的家兔KOA模型的軟骨損傷[15]。研究表明，KOA中局部炎癥因子的釋放與疼痛、腫脹和軟骨分解相關(guān)[16]。此外，KOA還會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，而大量的氧自由基又會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)期炎癥的病理發(fā)生和發(fā)展[17]。從牛膝中的主要有效成分槲皮素、山奈酚、黃芩素的藥理作用可以看出其在抗炎、抗氧化、減輕骨損傷等發(fā)面發(fā)揮著良好的作用[18-20]，故牛膝可被認(rèn)為是治療KOA的有效候選藥物。

從牛膝對(duì)KOA作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)及核心蛋白篩選的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-1β、JUN、CXCL8、CCL2、IL-10是牛膝作用于KOA的關(guān)鍵靶點(diǎn)。有研究顯示[21-23]，IL-1β和IL-6是在關(guān)節(jié)軟骨破壞和浸潤(rùn)過(guò)程中起主要作用的炎性細(xì)胞因子。趨化因子是骨關(guān)節(jié)疾病中關(guān)節(jié)組織代謝被破壞的介質(zhì)[24]，CCL2的升高可以反映骨/軟骨代謝的改變，導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞、介導(dǎo)KOA疼痛產(chǎn)生[25-27]。從PPI網(wǎng)絡(luò)及核心蛋白篩選結(jié)果中可以看出，牛膝治療KOA主要作用于與炎癥、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和凋亡等相關(guān)的靶點(diǎn)。

GO富集分析結(jié)果表明，在生物過(guò)程和分子功能中，細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子活性具有顯著意義。人類(lèi)關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，提高軟骨細(xì)胞的數(shù)量和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌成為治療骨性關(guān)節(jié)炎的一個(gè)重要突破點(diǎn)[28]細(xì)胞因子、趨化因子和共刺激分子等均能與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相互作用，共同調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收，進(jìn)而改變骨重塑的方向[29]。KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果顯示，牛膝治療KOA主要涉及晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體(AGEs-RAGE)、白介素17(IL-17)、腫瘤壞死因子(TNF)等信號(hào)通路。AGEs-RAGE信號(hào)通路富集最顯著，關(guān)節(jié)軟骨對(duì)AGE的積累特別敏感[30-31]，AGE的增加會(huì)減少關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中蛋白聚糖和膠原蛋白的合成。AGE的生物學(xué)活性被認(rèn)為是由AGE的特異性受體(RAGE)介導(dǎo)的，RAGE的激活參與了與促炎反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路，從而激活各種炎癥基因[32]。IL-17可以引起組織損傷和誘發(fā)自身免疫作用[33]。此外，IL-17還可以刺激許多趨化因子，引起滑膜中嗜中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的聚集，從而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大作用，導(dǎo)致更嚴(yán)重的關(guān)節(jié)損傷[34]。通過(guò)GO和 KEGG 富集分析結(jié)果表明，牛膝治療KOA涉及多方面生物學(xué)過(guò)程和多條重要信號(hào)通路參與，也明確了牛膝治療KOA的作用機(jī)制和有效性。

本研究表明，牛膝可以通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路機(jī)制協(xié)同治療KOA，為中藥牛膝治療KOA提供了重要的分子生物學(xué)科學(xué)依據(jù)，也為下一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)和方向。