羅欣劍， 孔曉英， 車昊昱， 邢 濤， 甄 峰，6， 孫永明

（1.中國科學院廣州能源研究所，廣東 廣州 510640； 2.中國科學院可再生能源重點實驗室，廣東 廣州 510640；3. 廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應用重點實驗室， 廣東 廣州 510640； 4. 中國科學院大學， 北京100049； 5.吉林大學 動物科學學院，吉林 長春 130062； 6.東北農業(yè)大學 工程學院， 黑龍江 哈爾濱 150030）

0 引言

秸稈是我國豐富的生物質資源之一，若處置不當，如采用傳統(tǒng)的焚燒處理，會造成嚴重的環(huán)境污染，從而危害人體健康。 干式厭氧發(fā)酵技術（發(fā)酵原料的TS 含量大于15%）能同時實現(xiàn)秸稈的生態(tài)循環(huán)利用和能量轉化，具有原料適用范圍廣、沼液產生少等特點，得到了各國的廣泛關注和研 究[1]，[2]。

目前，微氧處理在秸稈濕式厭氧發(fā)酵過程中已有研究，但所得結果具有爭議。 有研究表明，向發(fā)酵體系通入適量氧氣能增強原料的水解作用，提高甲烷產量，減少有毒代謝物（如乳酸和乙醇）的形成，提高纖維素酶和蛋白酶水解酶的活性[3]。Fu S F 的研究表明，在微氧濃度為5 mL/g 的條件下對玉米秸稈進行預處理后，濕式厭氧發(fā)酵產氣過程中的產甲烷率最高，比對照組提高了16.24%[4]。Tsapekos P 的研究表明， 在微氧濃度為5 mL/g 的條件下對麥稈進行預處理后，濕式厭氧發(fā)酵的產氣率最高，比對照組提高了7.2%，且確定了微氧濃度的臨界閾值為10 mL/g[5]。 Pedizzi C 的研究表明，以玉米飼料和豬糞為原料，當微氧濃度為4.3，8.8 mL/g 時， 濕式厭氧發(fā)酵過程中甲烷的生成率均下降了40%，并且在8.8 mL/g 的微氧濃度下，古菌群落發(fā)育較慢， 這表明微氧環(huán)境也可能對產甲烷菌的活性產生負面影響[6]。

本文擬采用微氧-厭氧發(fā)酵工藝，即在厭氧發(fā)酵啟動時構建不同的微氧環(huán)境， 直接進行高溫干式厭氧發(fā)酵試驗。 通過監(jiān)測累積產甲烷量、揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）濃度、pH 值和原料固體降解率等參數(shù)，考察玉米秸稈在微氧-厭氧干式發(fā)酵過程中的產氣特性。 同時，根據(jù)不同發(fā)酵時間，取樣并進行宏基因組分析，研究微氧-厭氧干式發(fā)酵過程中細菌和古菌的分布與變化，以探究微生物的演變規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米秸稈取自遼寧省營口市， 風干粉碎后過40 目篩備用。接種物取自本實驗室正常運行的高溫連續(xù)攪拌厭氧反應器 （Continuous Stirred Tank Reactor，CSTR），試驗前饑餓培養(yǎng)一周。 試驗原料及接種物的特性如表1 所示。

表1 試驗原料及接種物的特性Table 1 Properties of feedstock and inoculum

1.2 試驗方法

試驗使用有效容積為500 mL 的發(fā)酵瓶，設置發(fā)酵固體（以TS 計）濃度為16.5%，底物有機負荷為170.5 g/L， 添加0.74±0.01 g 尿素以調節(jié)發(fā)酵體系的C/N 為25。 所有物料加入后從反應器頂端通3 min 氮氣以排除空氣，再用針筒分別注入定量純氧，形成不同的微氧濃度。 各試驗組的設計見表2。

表2 試驗設計表Table 2 The design of experiment

取兩個發(fā)酵瓶分別添加130 mL 接種物，記錄其產氣，以扣除試驗過程中接種物的產氣。 將密閉的發(fā)酵瓶置于55±1 ℃的恒溫水浴鍋中，試驗期間每天早晚各手動震蕩1 次，當日產氣量低于總產氣量的1%時，停止試驗（每組試驗設置3 個平行樣）。 所有產氣數(shù)據(jù)和微氧濃度均以VS 計。為分析干式厭氧發(fā)酵過程中細菌和古菌的群落演替規(guī)律，每組選取兩個平行發(fā)酵瓶，在發(fā)酵的第2，6，10，14，19，27 天在發(fā)酵瓶底端取樣孔 處取樣， 將D-1 組的樣品分別標記為D-1-2，D-1-6，D-1-10，D-1-14，D-1-19，D-1-27，以此類推。 樣品保存在-20 ℃冰箱內以待分析。

1.3 測試和分析方法

根據(jù)APHA 標準方法測定TS 和VS 含量；采用Vario EL cube 元素分析儀 （德國Elementar 公司）測定C，H，N 和O 元素含量；采用雷磁pHS-3C 型pH 計（上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠）測定pH 值；采用Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）測定VFAs 濃度；采用島津GC 2014 型高效氣相色譜測定CH4和CO2等氣體的含量。

累積產氣率（mL/g） 和累積產甲烷率（mL/g）（以單位質量的VS 計）的計算式為

式中：VSd為降解后原料的固體含量，%；VSf為降解前原料的固體含量，%。

委托生工生物工程（上海）股份有限公司對樣品進行宏基因組測序分析。首先進行DNA 提取和擴 增， 使 用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit，OMEGA 的試劑盒提取DNA， 再用瓊脂糖凝膠檢測DNA 的完整性； 利用Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒對基因組DNA 精確定量， 以確定PCR 反應加入的DNA 量。古菌使用槽式PCR 擴增三輪，第一輪使用M-340F （5'-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3'），GU1ST-1000R（5'-GGCCATGCACYWCYTCT C-3'）引物擴增；第二輪使用第一輪PCR 產物進行擴增，PCR 所用的引物為融合了Miseq 測序平臺的V3-V4 通用引物：349F[5'-CCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTN（barcode）GYGCASCAGKCGM GAAW-3']引物和806R（5'-GACTGGAGTTCCTT GGCACCCGAGAATTCCAGGACTACVSGGGTATC TAAT-3'）引物；然后，引入Illumina 橋式PCR 兼容引物，進行第三輪擴增。細菌則在第一輪中使用引物341F[5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-3']， 第兩輪PCR 擴增使用引物805R（5'-GACTGGAGTTCCT TGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATC TAATCC3'）， 然后， 在第三輪使用Illumina 橋式PCR 兼容引物擴增。

進行DNA 純化回收后，定量混合樣品，每個樣品的DNA 量取10 ng， 使得最終上機測序濃度為20 pmol。 測序在Illumina HiSeq 2000（Illumina，San Diego，USA）上進行。 最后數(shù)據(jù)經過預處理后再分別進行OUT 聚類分析和生物多樣性分析，利用RDP 分類器將獲得的序列依次分為域、門、綱、目、科、屬6 個水平。

2 結果與討論

2.1 干式厭氧發(fā)酵的產氣性能

玉米秸稈干式厭氧發(fā)酵期間的累積產氣率和累積產甲烷率的變化情況如圖1 所示。

圖1 累積產氣率和累積產甲烷率的變化情況Fig.1 Cumulative gas production and cumulative methanogenic during dry anaerobic digestion

從圖1 可以看出：D-1 組 （微氧濃度為0.45 mL/g）的累積產甲烷率最高，為134.27±18.71 mL/g，比D-K 組（對照組）提高了8.11%；D-5 組（微氧濃度為4.51 mL/g）的累積產甲烷率最低，較D-K組降低了55.41%。當微氧濃度為0.45 mL/g 時，可提高玉米秸稈厭氧發(fā)酵的累積產甲烷率， 微氧濃度為1.13～4.51 mL/g 時， 累積產甲烷率隨著微氧濃度的提升而降低， 這可能是當氧氣濃度超過一定范圍時， 厭氧產甲烷菌的生長受到抑制而影響了產氣效果，這與付善飛的研究結論相一致[7]。

玉米秸稈干式厭氧發(fā)酵的產氣情況如表3 所示。 由表3 可知：D-1 組的平均甲烷濃度為54.12%，較D-K 組提升了8.92%；當微氧濃度為1.13～4.51 mL/g 時， 各試驗組的平均甲烷濃度較D-K 組大幅度降低， 其中，D-5 組的平均甲烷濃度最低，僅為39.63%，較D-K 組降低了20.24%。這可能與好氧細菌的增殖生成了更多的CO2，以及產甲烷菌豐度降低有關[8]。 隨著微氧濃度的增大，干式厭氧發(fā)酵的固體降解率隨之增高，較DK 組提升了19.35%～46.07%。 各試驗組的有效產氣時間T80（累積產甲烷率到達理論產甲烷率的80%所用的時間）為17 ～22 d，其中，D-1，D-2 和D-5 組的T80較D-K 組延后了1 d，D-3 和D-4組的T80較D-K 組延后了4 d， 即當微氧濃度為2.26～3.38 mL/g 時， 玉米秸稈干式厭氧發(fā)酵過程的T80明顯延長。

表3 干式厭氧發(fā)酵的產氣情況Table 3 Gas production performance of dry anaerobic digestion

2.2 VFAs 濃度和pH 值的變化規(guī)律

整個發(fā)酵周期內VFAs 濃度的變化規(guī)律如圖2 所示。 從圖2 可以看出：在第2 天，各試驗組的VFAs 濃度均比D-K 組低， 這是因為氧氣的添加減緩了VFAs 的生成速率并避免其快速積累；在第6 天， 僅有D-2，D-5 和D-K 組表現(xiàn)出VFAs濃度的降低， 其余組則表現(xiàn)出VFAs 濃度滯后降低的現(xiàn)象；在第10～19 天，各試驗組的VFAs 濃度急劇積累，并在第19 天達到峰值；D-3 和D-4 組的VFAs 濃度在第19 天達到峰值后，又很快消耗至較低水平，其余試驗組只消耗了一半的VFAs， 大量VFAs 仍停留在發(fā)酵體系中未被利用[9]。

圖2 發(fā)酵周期內VFAs 濃度的變化規(guī)律Fig.2 Variation of total volatile fatty acids during dry anaerobic digestion

干式厭氧發(fā)酵過程中VFAs 濃度的變化情況見表4。 由表4 可以看出：從第10 天開始，所有試驗組的丁酸濃度均占VFAs 濃度的90%以上，這與Lim J W 在試驗過程中觀察到的現(xiàn)象相一致[10]。乙酸僅在發(fā)酵的前6 天被檢測到，第2 天各試驗組的平均乙酸濃度為5 409 mg/L； 在第19天，除D-4 組外，其余試驗組的丁酸濃度均大于9 200 mg/L，出現(xiàn)明顯的丁酸累積現(xiàn)象。

表4 干式厭氧發(fā)酵過程中VFAs 濃度的變化情況Table 4 Variation of VFAs concentration during dry anaerobic digestion mg/L

pH 值是反映厭氧微生物生存環(huán)境的重要指標。 高溫厭氧發(fā)酵過程中，底物的水解速率較快，因而容易造成VFAs 的快速積累，發(fā)酵液的pH 值也隨之急劇下降[11]。 干式厭氧發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH 值的變化情況如圖3 所示。 從圖3 可以看出：在前6 d ，乙酸迅速被消耗的過程中，所有試驗組發(fā)酵液的pH 值未出現(xiàn)較大波動； 在第10～19 天丁酸積累的過程中， 所有試驗組發(fā)酵液的pH 值略有降低，但始終保持在正常水平。

圖3 干式厭氧發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH 值的變化規(guī)律Fig.3 Variation of pH value of fermentation broth during dry anaerobic digestion

2.3 微氧-厭氧干式發(fā)酵過程中微生物群落演替規(guī)律

2.3.1 細菌/古菌群落生物多樣性

以產氣性能為參考， 分別選取D-K，D-1 和D-4 組在第2，6，10，14，19，27 天取樣的測試結果，分析在完全厭氧環(huán)境、低微氧環(huán)境和高微氧環(huán)境下，玉米秸稈干式厭氧發(fā)酵過程中微生物群落的演替規(guī)律。 經過宏基因組測序分析，每個樣品的多樣性分析指數(shù)如表5 所示。各樣品的覆蓋率均大于0.99，表明大多數(shù)的細菌被大概率的檢測到， 即測試結果能代表樣品的真實情況。Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均是用來估算樣品中微生物多樣性的，Shannon 指數(shù)越大，說明群落的多樣性越高，Simpson 指數(shù)越大，說明群落的多樣性越低；Chao1 指數(shù)可以估計物種總數(shù)。 在整個厭氧發(fā)酵周期內，微氧組（D-1 和D-4）的細菌和古菌群落的多樣性均高于對照組（D-K），表明在微氧環(huán)境中，發(fā)酵體系的生物多樣性得到了提升；在前14 d，D-4 組的細菌群落多樣性高于D-1 組，表明高微氧濃度更有利于細菌群落的多樣性；在第6～14 天，3 個試驗組的古菌多樣性呈現(xiàn)出先急劇提升后又急劇下降的現(xiàn)象，推測是產甲烷代謝途徑的變化導致古菌群落結構的變化。在整個厭氧發(fā)酵過程中，3 個試驗組的細菌多樣性均呈現(xiàn)出遞減的趨勢，而古菌多樣性則呈現(xiàn)出遞增的趨勢。

表5 不同樣品的細菌和古菌多樣性指數(shù)分析Table 5 Analysis on bacterial and archaeal diversity index of different samples

2.3.2 細菌群落演替規(guī)律

各試驗組的細菌群落在門水平的分布如圖4所示。 從圖4 可以看出：D-K 組中僅存在11 種相對豐度高于1%的門水平物種，遠低于D-1 和D-4 組的20 種； 相較于D-K 組，D-1 和D-4 組的Proteobacteria 和Bacteroidetes 在第2，6 天顯示出更高的相對豐度； 第10 天，D-1 和D-4 組 的Proteobacteria的相對豐度分別快速提升到54%和49%，Chloroflexi 的相對豐度分別快速提升到6%和27.82%；在第10 天之后，隨著發(fā)酵時間的延長，3 個試驗組均表現(xiàn)出相同的變化趨勢，即Firmicutes 的 相 對 豐 度 上 升，Proteobacteria 和Bacteroidetes 的相對豐度緩慢下降。 D-1 和D-4組與D-K 組在門水平的差別主要體現(xiàn)在Firmicutes，Proteobacteria，Bacteroidetes 和Chloroflexi 的變化。

圖4 不同微氧環(huán)境下細菌群落在門水平上的相對豐度Fig.4 Relative abundance of Bacteria community at phylum level in different micro-aerobic environments

各試驗組的細菌群落在屬水平上的相對豐度如圖5 所示。 從圖5 可以看出：在D-K 組中，隨著發(fā)酵時間的延長，Clostridium III 的相對豐度 逐 漸 由 33% 降 至 13% ； 在 前 10 d，Defluviitalea 的相對豐度由17%逐漸降至2%，而Solibacillus 的相對豐度則在第10 天急劇升至7%。Clostridium III，Defluviitalea 和Petrimonas是D-K 組的主要水解菌屬，其協(xié)同作用對纖維素的降解有促進作用[12]。

從圖5 還可以看出：在D-1 組中，前6 d 的主 要 菌 屬 為 Clostridium III，Defluviitalea 和Petrimonas， 其相對豐度在第6 天分別達到了9%，20%和14%；在第10 天，3 種主要菌屬的相對豐度均急劇降低至4%以下，而Acinetobacter的相對豐度則急劇上升至45%，Levilinea 的相對豐度也提升至3%。 Acinetobacter 是嗜熱厭氧環(huán)境中的主要菌群， 在糖分的分解過程中發(fā)揮作用， 并能夠利用酚等苯環(huán)結構物質，Acinetobacter 的突然增加與有機質的快速降解密切相關。在第14 天之后，Clostridium III 和Petrimonas 為主要菌屬。Clostridium III 是Firmicutes 中的主要菌屬，能將復雜大分子轉化為醇、氫、二氧化碳和揮發(fā)性脂肪酸。 Ziganshin A M 的研究表明，Clostridium III 過多則預示著發(fā)酵反應體系的酸敗[13]。于佳動的研究表明，Clostridium III 相對豐度的升高不利于甲烷的生產[14]。 而在第10天檢測到的Clostridium III 的相對豐度急劇減小，且其相對豐度始終低于其他試驗組，對應了D-1 組最高的產甲烷率。 Clostridium III 的變化可能是影響厭氧發(fā)酵產甲烷性能的原因之一。

圖5 不同微氧環(huán)境下細菌群落在屬水平上的相對豐度Fig.5 Relative abundance of Bacteria community at genus level in different micro-aerobic environments

從圖5 還可以看出：在D-4 組中，前6 d 的主要 菌 屬 為 Clostridium III，Defluviitalea，Petri -monas 和Tepidimicrobium，其相對豐度在第6 天分別達到了19%，10%，5%和7%； 在第10 天，4 種主要菌屬的相對豐度均急劇降低至1%以下，而Acinetobacter 和Levilinea 的相對豐度分別急劇上升至28%和12%； 在第14 天之后， 僅剩Clostridium III 為主要的菌屬。 Levilinea 和Petrimonas 分別是Chloroflexi 和Bacteroidetes 中的主要菌屬，都能加強碳水化合物轉化為乙酸鹽和氫氣的能力[15]。

微氧組與對照組在細菌屬水平的主要變化體 現(xiàn) 在 Clostridium III，Defluviitalea，Acineto -bacter，Petrimonas 和Levilinea 5 種 菌 屬，其 協(xié) 同作用使得微氧處理組較對照組有更高的水解作用效果， 這與微氧試驗組得到較高的固體降解率相對應。另外，在3 個試驗組均觀察到能降解丁酸并且耐受氨的Syntrophomonas，其相對豐度在第14 天最高， 但僅為2%， 未能有效地降解丁酸，這與試驗中丁酸的積累相對應。可以進一步研究在玉米秸稈干式厭氧發(fā)酵過程中添加Syntrophomonas 對緩解丁酸抑制的作用。

2.3.3 古菌群落演替規(guī)律

各試驗組的古菌群落在屬水平上的相對豐度如圖6 所示。

圖6 不同微氧環(huán)境下古菌群落在屬水平上的相對豐度Fig.6 Relative abundance of Archaeal community at genus level in different micro-aerobic environments

從圖6 可以看出： 在D-K 組中，Methanobacterium 在整個發(fā)酵周期內都屬于主要菌屬，隨著厭氧發(fā)酵的進行，其相對豐度由97%逐漸降至64%； 與此同時，Methanomassiliicoccus 的相對豐度由0.2%逐漸升至21%。 Methanobacterium 是有機物厭氧處理過程中常見的氫營養(yǎng)型產甲烷菌屬，它能利用H2，CO2和甲酸產生甲烷[16]。 Methanomassiliicoccus 下僅有一個種， 即為Methanomassiliicoccus luminyensis， 它 能 利 用H2，CH3OH生長并產生甲烷[17]。 因此，在D-K 組中，氫營養(yǎng)型代謝過程是主要的甲烷產生途徑。

從圖6 還可以看出：在D-1 組中，在第6～10天，Methanobacterium 的相對豐度由92%急劇降至20%；與此同時，Methanothrix 的相對豐度由2%迅速升至50%； 在第14 天，Methanobacterium 的相對豐度又由20%迅速升至86%，Methanothrix的相對豐度由50%迅速降至3%。 Methanothrix 是厭氧發(fā)酵過程中分解乙酸的主要產甲烷菌，并且不利用H2，CO2和甲酸鹽[18]。 因此，在第6～14 天，D-1 和D-4 組可能主要進行乙酸型代謝產甲烷途徑。 在這個階段，兩種代謝途徑的菌屬共同作用，生物多樣性也最大，與多樣性分析相一致。

從圖6 還可以看出：在D-4 組中，在第6～14天，Methanobacterium 和Methanothrix 的相對豐度具有在D-1 組中相同的變化趨勢； 不同的是，在第10 天，Methanobacterium 的相對豐度降至2%，降幅更大， 且Methanothrix 的相對豐度急劇升至52%，與D-1 組中的變化趨勢相同，而D-4 組的有效產氣時間更長，這可能與不同主要產甲烷途徑菌屬的轉變有關；在第16 天，Methanothrix 的相對豐度降至18%，降幅較D-1 組更小。 Li W W 認為Methanothrix 和Methanomassiliicoccus 促進了纖維素類原料降解的程度并有助于甲烷的生成，這也與微氧處理組較對照組有更高的固體降解率相一致[19]。

總體而言， 在整個厭氧發(fā)酵周期內，D-K 組的優(yōu)勢菌屬為Methanobacterium 和Methanomassiliicoccus， 主要進行氫營養(yǎng)型代謝產甲烷途徑。 而微氧試驗組的優(yōu)勢菌屬較D-K 組多出了Methanothrix。 Methanothrix 是乙酸型代謝產甲烷途徑的主要菌屬。在干式厭氧發(fā)酵過程中，微氧環(huán)境改變了發(fā)酵體系中兩種主要產甲烷代謝途徑菌屬的相對豐度。

3 結論

①當微氧濃度為0.45 mL/g 時，厭氧發(fā)酵獲得了最大的累積產氣率和累積產甲烷率， 分別為244.19±25.53，134.27±18.71 mL/g， 較對照組分別提高了3.40%和8.11%。

②在整個厭氧發(fā)酵過程中， 細菌群落多樣性呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢， 而古菌群落多樣性呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢；在微氧環(huán)境下，Clostridium III，Defluviitalea，Acinetobacter，Petrimonas 和Levilinea 是細菌屬水平的主要菌屬，Methanobacterium，Methanomassiliicoccus 和Methanothrix 是古菌屬水平的主要菌屬， 主要菌屬的協(xié)同作用使得微氧處理組較對照組有更高的水解作用效果和更高的固體降解率。

③在第6～14 天，微氧試驗組的Acinetobacter菌屬（細菌）和Methanothrix 菌屬（古菌）的相對豐度均出現(xiàn)急劇增加的現(xiàn)象； 微氧試驗組的主要菌屬包含了氫營養(yǎng)型和乙酸型代謝產甲烷途徑的菌屬，而對照組的主要菌屬僅為氫營養(yǎng)型代謝產甲烷途徑的菌屬。