陳燕燕，徐 魏，向 力，岳 靜，李興元，王 露，鄭 飛 ，唐俊明,4，鄭 敏

心力衰竭是一種預(yù)后不良的臨床綜合征，其特征是運(yùn)動(dòng)不耐受、早期疲勞和與萎縮相關(guān)的骨骼肌病[1]，骨骼肌病是心力衰竭患者運(yùn)動(dòng)能力受限的主要決定因素[2]。長(zhǎng)期以來(lái)交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活和副交感神經(jīng)系統(tǒng)的抑制被認(rèn)為是心力衰竭臨床綜合征的表現(xiàn)[3]。有研究[1]表明交感神經(jīng)長(zhǎng)期過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致心力衰竭患者誘發(fā)骨骼肌病，但相關(guān)機(jī)制知之甚少。課題組之前已證實(shí)異丙腎上腺素的持續(xù)刺激通過(guò)激活β1受體并失活β2受體抑制小鼠成肌細(xì)胞C2C12的分化、融合和肌管形成[4]，但是否α受體也參與了交感神經(jīng)長(zhǎng)期過(guò)度激活誘發(fā)骨骼肌病的病理過(guò)程，未有研究涉及。該研究應(yīng)用選擇性α2受體激動(dòng)劑—右美托咪定刺激C2C12細(xì)胞，來(lái)揭示交感神經(jīng)長(zhǎng)期過(guò)度激活與C2C12細(xì)胞增殖、分化和肌管形成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料C2C12成肌細(xì)胞系(簡(jiǎn)稱C2C12細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；馬血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；0.25%胰蛋白酶購(gòu)自武漢安特捷生物技術(shù)有限公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司；高糖DMEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1CCK-8法檢測(cè)右美托咪定對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的影響 取1 ml待傳代的C2C12細(xì)胞懸液接種于75 cm2的培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基(增殖培養(yǎng)基)，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×105/ml，將C2C12細(xì)胞接種于4個(gè)96孔板中，每個(gè)96孔板接種30個(gè)孔，每孔接種100 μl細(xì)胞懸液，將全部96孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待C2C12細(xì)胞增殖培養(yǎng)24 h后，將增殖培養(yǎng)基換成無(wú)血清高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每個(gè)96孔板的30個(gè)孔分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)分組，每組5個(gè)復(fù)孔，6個(gè)實(shí)驗(yàn)分組分別為對(duì)照組(右美托咪定0 mmol/L)和右美托咪定5個(gè)濃度梯度組(5、10、20、40、80 mmol/L)。將無(wú)血清高糖培養(yǎng)基換成增殖培養(yǎng)基，并按分組分別加入不同濃度的右美托咪定，4個(gè)96孔板分別培養(yǎng)12、24、48、72 h后，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5 h，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔細(xì)胞在450 nm處的吸光度值。

1.2.2C2C12細(xì)胞分化體系的建立 C2C12細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇并接種于75 cm2的培養(yǎng)皿中, 培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(增殖培養(yǎng)基)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞增殖融合達(dá)80%～90%時(shí)，按1 ∶3傳代，傳代的C2C12細(xì)胞按上述條件繼續(xù)培養(yǎng), 以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。C2C12細(xì)胞在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng), 待細(xì)胞增殖融合至70%時(shí), 換用含2%馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(分化培養(yǎng)基)誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化。每隔1 d換1次分化培養(yǎng)基, 同時(shí)每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞的分化情況。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及給藥方式

1.2.3.1實(shí)驗(yàn)分組 右美托咪定按濃度梯度分成6組：對(duì)照組(0 mmol/L)，實(shí)驗(yàn)組(5、10、20、40、80 mmol/L)。單次給藥和連續(xù)單次給藥均按這6組濃度梯度給藥。

1.2.3.2右美托咪定的給藥方式 單次給藥：在增殖培養(yǎng)基中C2C12細(xì)胞增殖融合至70%時(shí), 換成分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化, 此時(shí)加入右美托咪定, 隨后不再加入右美托咪定，并每隔1 d換分化培養(yǎng)基; 連續(xù)培養(yǎng)6 d。連續(xù)單次給藥: 在增殖培養(yǎng)基中C2C12細(xì)胞增殖融合至70%時(shí), 換成分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化, 此時(shí)加入右美托咪定, 隨后每天加入右美托咪定，并每隔1 d換分化培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)6 d。

1.2.4細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測(cè) C2C12細(xì)胞按每孔1.25×104/ml密度接種于24孔板中, 待細(xì)胞貼壁并增殖融合至70%時(shí)，換成分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化, 按上述實(shí)驗(yàn)分組分別單次給藥和連續(xù)單次給藥，連續(xù)培養(yǎng)6 d，然后棄分化培養(yǎng)基，1×PBS連續(xù)清洗3次，4%的多聚甲醛固定15 min, 再用1×PBS振蕩清洗3次, 每次5 min, 然后用5%的山羊血清和0.3%Triton X-100室溫封閉1 h。封閉后的細(xì)胞每孔分別加入抗體稀釋液稀釋的肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MYH)(貨號(hào)：sc-376157, 抗體稀釋：1 ∶100,美國(guó)Santa Cruze公司)，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(myocyte enhancer factor 2C，MEF2C)(貨號(hào)：#5030,抗體稀釋：1 ∶400，美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，肌細(xì)胞生成蛋白(myogenin，MyoG)(貨號(hào)：sc-12732,抗體稀釋：1 ∶50,美國(guó)Santa Cruze公司)，其中MYH和MEF2C加入同一孔中，進(jìn)行熒光雙染，MyoG加入不同孔中，進(jìn)行熒光單染，將24孔板放入4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。然后用1×PBS振蕩清洗3次, 每次5 min,在加了MYH和MEF2C熒光一抗的孔中加入抗兔的熒光二抗(1 ∶300), 在加了MyoG的熒光一抗的孔中加入抗鼠的熒光二抗(1 ∶300),室溫孵育1 h, 再用1×PBS振蕩清洗3次, 每次5 min,后加入DAPI 200 μl, 避光室溫15 min,再用1×PBS振蕩清洗3遍, 每次5 min,然后在倒置熒光顯微鏡下觀察并攝片。

2 結(jié)果

2.1 α2腎上腺素能受體在C2C12細(xì)胞的表達(dá)特征免疫熒光結(jié)果顯示, 在C2C12細(xì)胞的增殖、分化階段呈現(xiàn)出α2腎上腺素能受體陽(yáng)性的特征(圖1)。

圖1 α2腎上腺素能受體在增殖和分化C2C12細(xì)胞的表達(dá)特征 ×200A: 增殖階段；B：分化階段

2.2 右美托咪定對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的影響CCK-8結(jié)果顯示，第12、24、48、72 h分組中，與對(duì)照組相比，除第12 h分組中，只右美托咪定(40、80 mmol/L)兩個(gè)高濃度組呈抑制C2C12細(xì)胞增殖外，其他3個(gè)分組中，不同濃度的右美托咪定均抑制C2C12細(xì)胞的增殖，且隨著濃度的增加，抑制作用越明顯(圖2)。

圖2 CCK-8法檢測(cè)不同濃度右美托咪定對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組比較：*P<0.05

2.3 C2C12細(xì)胞分化體系的建立C2C12細(xì)胞經(jīng)常規(guī)傳代后接種在75 cm2的培養(yǎng)皿中, 在倒置顯微鏡下觀察, 細(xì)胞貼壁鋪開(kāi)后多呈梭形或有突起,核為橢圓形, 單核, 核仁明顯。待細(xì)胞增殖至70%時(shí), 更換為分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化。分化的細(xì)胞呈現(xiàn)多核、串珠樣排列, 并形成肌管。第0、2、4、6天相比，隨著時(shí)間的推移肌管細(xì)胞核融合數(shù)目逐漸增多，且在分化第6天達(dá)到高峰(圖3)。

2.4 不同給藥方式下，右美托咪定對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響免疫熒光結(jié)果顯示，不論單次給藥還是連續(xù)單次給藥，與對(duì)照組相比，右美托咪定均呈現(xiàn)抑制肌管形成(MYH)和MEF2C、MyoG表達(dá)的現(xiàn)象，但連續(xù)單次給藥組抑制肌管形成(MYH)和MEF2C、MyoG表達(dá)的作用比單次給藥組顯著(圖4、5、6)。 將肌管分成細(xì)胞核融合數(shù)目為3～5、5～10、>10的3個(gè)不同分組，顯示在較高濃度組(20、40、80 mmol/L組)，連續(xù)單次給藥抑制肌管形成的作用強(qiáng)于單次給藥，3個(gè)肌管細(xì)胞核融合數(shù)目分組均抑制，而單次給藥只在細(xì)胞核融合數(shù)目>10組抑制作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，肌管細(xì)胞核融合的3個(gè)分組中，右美托咪定(80 mmol/L)組與對(duì)照組相比，單次給藥組：F=1.30，P<0.05；F=2.26，P<0.5；F=8.55，P<0.05；連續(xù)單次給藥組：F=25.83，P<0.05；F=9.00，P<0.05；F=1.45，P<0.05(圖4、5)。

圖4 單次給予不同濃度右美托咪定對(duì)C2C12細(xì)胞分化、融合為多細(xì)胞核的肌管數(shù)和MEF2C表達(dá)的影響 ×200A: 單次給不同濃度右美托咪定逐漸抑制C2C12細(xì)胞分化的肌管形成(MYH)和MEF2C表達(dá)的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色; B～D:單次給不同濃度右美托咪定對(duì)C2C12細(xì)胞分化為含有不同數(shù)目細(xì)胞核的肌管數(shù)的影響；綠色：MYH陽(yáng)性；紅色：MEF2C陽(yáng)性；藍(lán)色：DAPI染的細(xì)胞核；與對(duì)照組比較：*P<0.05

圖5 連續(xù)單次給予不同濃度右美托咪定對(duì)C2C12細(xì)胞分化、融合為多細(xì)胞核的肌管數(shù)和MEF2C表達(dá)的影響 ×200A：連續(xù)單次給不同濃度右美托咪定逐漸抑制C2C12細(xì)胞分化的肌管形成(MYH)和MEF2C表達(dá)的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色；B～D：連續(xù)單次給不同濃度右美托咪定對(duì)C2C12細(xì)胞分化為含有不同數(shù)目細(xì)胞核的肌管數(shù)的影響；綠色：MYH陽(yáng)性；紅色：MEF2C陽(yáng)性；藍(lán)色：DAPI染的細(xì)胞核；與對(duì)照組比較：*P<0.05

圖6 單次和連續(xù)單次給予不同濃度右美托咪定對(duì)C2C12細(xì)胞分化的MyoG表達(dá)的影響 ×200A: 單次給不同濃度右美托咪定逐漸抑制C2C12細(xì)胞分化的MyoG表達(dá)的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色; B:連續(xù)單次給不同濃度右美托咪定逐漸抑制C2C12細(xì)胞分化的MyoG表達(dá)的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色；綠色：MyoG陽(yáng)性；藍(lán)色：DAPI染的細(xì)胞核

2.5 不同分化時(shí)間，右美托咪定對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響免疫熒光結(jié)果顯示，右美托咪定(20 mmol/L)組與對(duì)照組相比，在C2C12細(xì)胞分化的第2、4、6天均呈現(xiàn)右美托咪定抑制肌管形成(MYH)和MEF2C、MyoG表達(dá)的現(xiàn)象，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用越明顯(圖7)。

圖7 連續(xù)單次給予右美托咪定(20 mmol/L)時(shí)間依賴性抑制C2C12細(xì)胞分化、融合、肌管形成和MEF2C、MyoG的表達(dá) ×200A:用免疫熒光染色法檢測(cè)不給予或連續(xù)單次給予右美托咪定(20 mmol/L)后C2C12細(xì)胞分化第2、4、6天的肌管形成(MYH)和MEF2C表達(dá)；綠色：MYH陽(yáng)性；紅色：MEF2C陽(yáng)性；藍(lán)色：DAPI染的細(xì)胞核；B：用免疫熒光染色法檢測(cè)不給予或連續(xù)單次給予右美托咪定(20 mmol/L)后C2C12細(xì)胞分化第2、4、6天的MyoG表達(dá)；綠色：MyoG陽(yáng)性；藍(lán)色：DAPI染的細(xì)胞核

3 討論

本研究利用國(guó)內(nèi)外通用的C2C12細(xì)胞作為研究對(duì)象，用免疫熒光的方法首次證實(shí)了C2C12細(xì)胞在增殖、分化階段均有α2受體的表達(dá)，提示交感神經(jīng)過(guò)度激活分泌的兒茶酚胺可能通過(guò)與骨骼肌上的α2受體結(jié)合而發(fā)揮作用。在增殖階段，用CCK-8法證實(shí)了右美托咪定在C2C12細(xì)胞增殖的第12、24、48、72 h均能抑制其增殖，且有濃度依賴性，說(shuō)明交感神經(jīng)過(guò)度激活可能通過(guò)抑制成肌細(xì)胞的增殖而導(dǎo)致骨骼肌萎縮。在分化階段，利用C2C12細(xì)胞建立了骨骼肌細(xì)胞的分化體系, 免疫熒光結(jié)果證實(shí)連續(xù)單次給藥，與對(duì)照組相比，不同濃度右美托咪定均抑制C2C12的分化和肌管的形成，且隨著濃度的增加，抑制作用越明顯；而單次給藥，只有在高濃度組，才有明顯的抑制作用。而且在連續(xù)單次給藥組，C2C12細(xì)胞分化進(jìn)而導(dǎo)致多細(xì)胞融合形成肌管的能力隨著濃度的增加而逐漸降低, 這與臨床交感神經(jīng)長(zhǎng)期過(guò)度激活造成骨骼肌萎縮的臨床表現(xiàn)一致。所以連續(xù)單次給予右美托咪定建立模擬機(jī)體交感神經(jīng)長(zhǎng)期過(guò)度激活造成骨骼肌萎縮的模型更接近臨床，且更有臨床意義。

骨骼肌再生是一個(gè)高度復(fù)雜的過(guò)程，是由肌肉特異性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子(myogenic regulatory factors，Mrfs)家族和MEF2家族共同參與的[5]。Mrfs家族包括肌原性分化抗原(MyoD)、MyoG、肌源性因子5(Myf5)和肌源性調(diào)節(jié)因子4(Mrf4)；MEF2家族包括MEF2A、-B、-C and -D，這兩類轉(zhuǎn)錄因子直接相互作用，為骨骼肌基因的激活建立了獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄密碼[6]。其中MyoG的表達(dá)發(fā)生在肌管形成開(kāi)始時(shí)，是導(dǎo)致C2C12細(xì)胞融合的關(guān)鍵因素[7]；而激活的MEF2C誘導(dǎo)并加強(qiáng)C2C12細(xì)胞的分化[6,8]。

本研究同時(shí)分析了右美托咪定對(duì)C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中MyoG和MEF2C表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)右美托咪定抑制MEF2C和MyoG表達(dá)的作用與抑制C2C12細(xì)胞分化、融合及肌管形成(MYH)和的作用相一致，同樣具有濃度依賴性，同樣是連續(xù)單次給藥比單次給藥抑制作用明顯，提示右美托咪定抑制肌管形成(MYH)與抑制MEF2C、MyoG的表達(dá)有關(guān)。

由于連續(xù)單次給藥組的右美托咪定(20 mmol/L)抑制C2C12細(xì)胞的肌管形成，但不影響C2C12細(xì)胞的數(shù)量，故利用免疫熒光分別測(cè)定對(duì)照組和連續(xù)單次給藥的右美托咪定(20 mmol/L)組中C2C12細(xì)胞分化第2、4、6天的肌管形成情況和MEF2C、MyoG的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，右美托咪定(20 mmol/L)組抑制C2C12細(xì)胞分化第2、4、6天的肌管形成(MYH)和MEF2C、MyoG的表達(dá)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用越明顯，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了右美托咪定對(duì)C2C12細(xì)胞從分化到肌管形成的整個(gè)過(guò)程均有抑制作用。

綜上，本研究首次證實(shí)了C2C12細(xì)胞在增殖、分化階段均有α2受體的表達(dá)，且右美托咪定可能通過(guò)與C2C12細(xì)胞上的α2受體結(jié)合而抑制C2C12細(xì)胞的增殖、分化和肌管形成，而MEF2C和MyoG表達(dá)的變化特征說(shuō)明右美托咪定通過(guò)抑制MEF2C和MyoG的表達(dá)而抑制C2C12細(xì)胞的分化和肌管形成，但右美托咪定對(duì)C2C12細(xì)胞抑制作用的具體分子機(jī)制在本研究中并未涉及，需進(jìn)一步探究。本研究首次證實(shí)了心力衰竭患者交感神經(jīng)長(zhǎng)期過(guò)度激活導(dǎo)致的骨骼肌病可能涉及的新機(jī)制，為臨床骨骼肌病的發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。