王 濤，馬牧原，葉曉鋒

胃癌是全球第五大最常見的腫瘤，也是第三大最致命的腫瘤，在中國，每年報告超過40萬例新病例，占全球總數(shù)的42%[1]。在過去的幾十年中，盡管胃癌的診斷和治療得到了顯著改善，但患者的5年生存率仍然很低[2]，因此有必要探索胃癌新型治療靶標的分子機制和鑒定。研究[3]報道表觀遺傳學在胃癌的進展中發(fā)揮重要調(diào)控作用，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)屬于表觀遺傳學的一種，在人類惡性腫瘤的發(fā)病機制中具有重要作用。lncRNA序列相似性家族83成員H反義RNA 1(lncRNA family with sequence similarity 83 member H antisense RNA 1, lncRNA FAM83H-AS1)是新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA之一，在肝細胞肝癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌等惡性腫瘤中高表達，發(fā)揮促癌基因作用[4-6]。Da et al[7]報道FAM83H-AS1在胃癌組織中表達上調(diào)，并與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預后相關。該文探討了FAM83H-AS1在胃癌中發(fā)揮的具體作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與材料人胃癌細胞系MKN-45、SGC-7901、MGC-803和人永生化正常胃上皮細胞GES-1(美國ATCC細胞庫)，DMEM-F12培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國gibco公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄、SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，siRNA(廣州銳博生物)，細胞周期檢測試劑盒和BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物)，MTS試劑(美國Biovision公司)，Transwell小室(美國BD公司)；蛋白裂解液(北京索萊寶生物)，cyclinD1、CDK4、E鈣黏蛋白、N鈣黏蛋白和波形蛋白抗體(美國proteintech公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染MKN-45和SGC-7901細胞培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基，MGC-803和GES-1細胞培養(yǎng)基為DMEM-F12，胎牛血清濃度均為10 %，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。將呈對數(shù)生長期的MKN-45細胞以1.0×105個/孔鋪至6孔板中，分為對照組(si-NC)和實驗組(si-FAM83H-AS1)，將NC siRNA和FAM83H-AS1 siRNA與lip2000混勻后加入各組細胞中，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 qRT-PCR檢測FAM83H-AS1的表達胰酶消化離心收集細胞，加入TRIzol試劑裂解細胞，提取細胞中總RNA。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，并以cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR試劑盒配制反應體系進行qRT-PCR，按2步反應進行，即95 ℃預變性5 s，以 95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s進行40個循環(huán)。每個反應樣品設置3個復孔，獲得各樣品的循環(huán)閾值(threshold cvcle，Ct)，以2-ΔΔCt公式計算FAM83H-AS1相對表達量。FAM83H-AS1引物F: 5′-TAGGAAACGAGCGAGCCC-3′, R: 5′- GCTTTGGGTCTCCCCTTCTT-3′。內(nèi)參GAPDH引物F:5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′,R: 5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。

1.4MTS收集生長狀態(tài)良好的MKN-45細胞以2 000個/孔鋪至96孔板中，分為對照組(si-NC)和實驗組(si-FAM83H-AS1)，每組設置5個復孔，按上述siRNA轉(zhuǎn)染方法進行轉(zhuǎn)染，分別在轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h時，每孔加入20 μl MTS試劑在培養(yǎng)箱中孵育2 h，全波長掃描儀檢測490 nm的吸光度(optical density,OD)值。

1.5 平板克隆形成實驗收集生長狀態(tài)良好的MKN-45細胞以300個/孔鋪至6孔板中，分為si-NC和si-FAM83H-AS1，每組設置3個復孔，按上述siRNA轉(zhuǎn)染方法進行轉(zhuǎn)染，細胞形成肉眼可見的細胞克隆團時終止培養(yǎng)，PBS洗3次，甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色，計數(shù)克隆團個數(shù)。

1.6 Transwell實驗收集6孔板中轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞，基礎培養(yǎng)基洗3次后細胞計數(shù)，1×105個細胞重懸于100 μl基礎血清培養(yǎng)基中加至Transwell小室膜上，膜下加入含10%胎牛血清的500 μl培養(yǎng)基，每組設置3個復孔，放置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后終止培養(yǎng)，將未轉(zhuǎn)移的細胞洗去，甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)。

1.7 Western blot檢測蛋白表達收集6孔板中轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞，加入蛋白裂解液，超聲裂解10 min，4 ℃高速離心20 min，去除細胞碎片。檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸變性，進行電泳分離蛋白(80 V, 2 h)，蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上(350 mA, 2 h)，5% 脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜，室溫二抗孵育2 h，ECL超敏化學發(fā)光曝光，Image J軟件進行蛋白灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 FAM83H-AS1在胃癌細胞系中的表達水平采用qRT-PCR檢測FAM83H-AS1在人胃癌細胞系MKN-45、SGC-7901、MGC-803和人永生化正常胃上皮細胞GES-1中的表達情況，F(xiàn)AM83H-AS1在胃癌細胞中的表達高于在人永生化正常胃上皮細胞GES-1中的表達，在MKN-45細胞中的表達最高(P<0.05)，見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測FAM83H-AS1在胃癌細胞系中的表達情況與GES-1比較：*P<0.05

2.2 FAM83H-AS1 siRNA轉(zhuǎn)染效果驗證FAM83H-AS1 siRNA干擾MKN-45細胞中FAM83H-AS1的表達效果。與si-NC相比，si-FAM83H-AS1組中FAM83H-AS1相對表達量降低(P<0.05)。FAM83H-AS1 siRNA可以干擾MKN-45細胞中FAM83H-AS1的表達，見圖2。

圖2 qRT-PCR 驗證FAM83H-AS1干擾慢病毒感染效果與si-NC比較：*P<0.05

2.3 流式細胞儀檢測細胞周期FAM83H-AS1 siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞MKN-45 48 h后，與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組細胞阻滯在G0/G1期(P<0.05)，見圖3。

圖3 MTS檢測干擾FAM83H-AS1的表達對MKN-45細胞周期的影響與si-NC比較：*P<0.05

2.4 MTS檢測細胞增殖能力FAM83H-AS1 siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞MKN-45 48 h后，MTS實驗檢測結(jié)果顯示與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組細胞增殖能力降低(P<0.05)，見圖4。

圖4 MTS檢測干擾FAM83H-AS1的表達對MKN-45細胞增殖的影響與si-NC比較：*P<0.05

2.5 平板克隆檢測細胞克隆形成平板克隆形成實驗檢測顯示與si-NC組比較，si-FAM83H-AS1組細胞克隆形成能力降低(P<0.05)，見圖5。

圖5 平板克隆實驗檢測干擾FAM83H-AS1的表達對MKN-45細胞克隆形成能力的影響與si-NC比較：*P<0.05

2.6 Transwell實驗檢測細胞轉(zhuǎn)移能力FAM83H-AS1 siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞MKN-45 48 h后Transwell實驗檢測顯示與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組轉(zhuǎn)移能力降低(P<0.05)，見圖6。

圖6 Transwell實驗檢測干擾FAM83H-AS1的表達對MKN-45細胞轉(zhuǎn)移能力的影響 ×200與si-NC比較：*P<0.05

2.7 FAM83H-AS1對細胞周期蛋白的影響收集轉(zhuǎn)染48 h的各組蛋白，Western blot實驗顯示與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組細胞中cyclinD1和細胞周期蛋白依賴激酶4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)蛋白的表達降低(P<0.05)，見圖7、表1。

表1 各組細胞中細胞周期蛋白的相對表達量

圖7 Western blot實驗檢測干擾FAM83H-AS1的表達對MKN-45細胞中周期蛋白的影響

2.8 FAM83H-AS1對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程 (epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影響收集轉(zhuǎn)染48 h的各組蛋白，Western blot實驗顯示與si-NC組相比，si-FAM83H-AS1組細胞中EMT標志蛋白E鈣黏蛋白蛋白表達增加，N鈣黏蛋白和波形蛋白蛋白表達降低(P<0.05)，見圖8、表2。

圖8 western blot實驗檢測干擾FAM83H-AS1的表達對MKN-45細胞EMT的影響

表2 各組細胞中EMT標志蛋白的相對表達量

3 討論

個體化精準治療-分子靶向治療已經(jīng)應用于其它晚期惡性腫瘤治療[8]，但由于胃癌強大的異質(zhì)性，胃癌的分子靶向藥物目前仍處于臨床研究階段[9]，因此在分子水平探索胃癌的進展機制，有助于胃癌治療靶點的研究。

lncRNA的發(fā)現(xiàn)為研究胃癌惡性表型的潛在生物學機制提供了見解，lncRNA是長度>200個核苷酸的RNA，其可通過與蛋白質(zhì)、RNA和DNA或其他細胞大分子相互作用介導各種細胞生物學過程[3]。胃癌中越來越多表達失調(diào)的lncRNA逐漸被發(fā)現(xiàn)，其中胃癌組織中FAM83H-AS1表達增加，并且是胃癌總生存率和無進展生存期的危險因素[7]。而研究[5-6]報道FAM83H-AS1在肝細胞肝癌組織、結(jié)直腸癌組織、卵巢癌等多種惡性腫瘤中高表達，與腫瘤患者不良病理參數(shù)和患者預后不良相關，并且FAM83H-AS1與這些腫瘤的惡性生物學行為密切相關。敲低FAM83H-AS1可以顯著抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[4]。siRNA抑制細胞中FAM83H-AS1的表達后降低結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移并增加凋亡[5]。FAM83H-AS1是否與胃癌增殖轉(zhuǎn)移有關引起了關注，本文在細胞水平檢測了FAM83H-AS1在胃癌中的表達情況，結(jié)果顯示FAM83H-AS1在胃癌細胞中表達上調(diào)，并選擇其表達最高的MKN-45胃癌細胞系抑制FAM83H-AS1的表達，生物學功能實驗顯示干擾FAM83H-AS1的表達誘導胃癌細胞阻滯在G0/G1期，并抑制胃癌細胞的增殖活性和轉(zhuǎn)移能力。與Shan et al[10]報道的沉默F(xiàn)AM83H-AS1表達可抑制膀胱癌細胞增殖和遷移，并誘導G0 / G1期細胞周期停滯的研究一致。

FAM83H-AS1在胃癌中為促癌因子，其發(fā)揮作用的具體機制仍需進一步研究。細胞周期調(diào)控失控導致腫瘤細胞的惡性增殖是腫瘤的重要特征，在生理狀態(tài)下細胞具有嚴密的周期調(diào)控機制，其中細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶發(fā)揮關鍵作用。細胞周期蛋白CyclinD1是原癌基因，由于基因擴增、轉(zhuǎn)錄增強和染色體易位等導致其蛋白過度表達，過度表達的CyclinD1與CDK4結(jié)合，兩者均是周期正性調(diào)控因子，促使細胞從G0/G1期進入S期，促進細胞分裂增殖[11]。本文采用Western blot實驗檢測表明抑制FAM83H-AS1的表達后，胃癌細胞中cyclinD1和CDK4蛋白的表達降低。表明FAM83H-AS1可能通過減少細胞周期cyclinD1和CDK4蛋白的表達抑制細胞的增殖。EMT是上皮細胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的細胞的生物學過程，其在胚胎發(fā)育生理過程和腫瘤轉(zhuǎn)移病理過程中均發(fā)揮重要作用[12]。研究[13]報道抑制腫瘤細胞的EMT，腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱，EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機制之一，Western blot實驗結(jié)果顯示干擾FAM83H-AS1的表達后，胃癌細胞中上皮細胞標志分子E-cadherin蛋白表達增加，而間質(zhì)細胞標志物分子N-cadherin和Vinmentin蛋白表達降低。表明FAM83H-AS1在胃癌中通過調(diào)控EMT促進細胞轉(zhuǎn)移。