邵璐 葉蔚 魏霞

[摘要] 目的 觀察與比較二乙基二硫代氨基甲酸鹽（DDC）高劑量恒量腹腔注射、DDC遞增法腹腔注射、二丁基二氯化錫（DBTC）一次性尾靜脈注射三種慢性胰腺炎胰腺纖維化大鼠造模方法。 方法 48只SD大鼠隨機分成生理鹽水腹腔注射組（對照組）、DDC高劑量恒量腹腔注射組（DDC恒量組）、DDC遞增法腹腔注射組（DDC遞增組）、DBTC一次性尾靜脈注射組（DBTC組）。采取相應的造模措施，4周后處理大鼠，全自動生化分析儀檢測血淀粉酶，ELISA 法檢測透明質酸，HE染色及Masson染色檢測胰腺組織病理學，并進行病理評分和纖維化評分。 結果 DBTC組大鼠存活率低于對照組（P<0.05），其他各組間相比均無統(tǒng)計學差異（P均>0.05），三組造模組血淀粉酶、透明質酸、病理評分、纖維化評分均顯著高于對照組（P均<0.01），其中DDC恒量組與DDC遞增組相比組間無差異，DBTC組高于其他各組（P均<0.05）。 結論 DBTC一次性尾靜脈注射法造模的大鼠胰腺纖維化最顯著，比較符合人類慢性胰腺炎的發(fā)病機制和病理組織學改變。

[關鍵詞] 慢性胰腺炎;胰腺纖維化;大鼠模型;病理評分

[中圖分類號] R285.5 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）24-0031-04

[Abstract] Objective To observe and compare three kinds of chronic pancreatitis models of rats with pancreatic fibrosis：high dose and constant intraperitoneal injection of diethyldithiocarbamate（DDC）， intraperitoneal injection of DDC incremental method and one-time tail vein injection of dibutyltin dichloride（DBTC）. Methods 48 SD rats were randomly divided into three groups：normal saline intraperitoneal injection group（Control group）， DDC high dose constant intraperitoneal injection group（DDC constant group）， DDC incremental intraperitoneal injection group（DDC incremental group） and DBTC one-time tail vein injection group（DBTC group）. After 4 weeks， the rats were treated， the amylase in blood was detected by automatic biochemical analyzer， hyaluronic acid was detected by ELISA， the histopathology of pancreas was detected by HE staining and Masson staining， and the pathological score and fibrosis score were made. Results The survival rate of rats in DBTC group was lower than that in the control group（P<0.05）， and there was no statistical difference among other groups（P>0.05）. The serum amylase， hyaluronic acid， pathological score and fibrosis score in the three groups were significantly higher than those in the control group（P<0.01）. There was no difference between DDC constant group and DDC increasing group，and DBTC group was higher than other groups（P<0.05）. Conclusion The pancreatic fibrosis induced by DBTC is the most significant in rats，which is consistent with the pathogenesis and histopathological changes of human chronic pancreatitis.

[Key words] Chronic pancreatitis; Pancreatic fibrosis; Rat model; Pathological score

慢性胰腺炎（Chronic pancreatitis，CP）是消化系統(tǒng)的常見疾病，由多種原因引起的胰腺組織和功能反復或持續(xù)性的損害，造成不可逆轉改變的一種慢性炎性疾病[1]，其主要的病理特征為胰腺纖維化[2]，臨床常表現為反復發(fā)作的腹痛及內、外分泌功能不全[3]。迄今為止，國內外諸多學者已經制備了各種CP的動物模型，但尚未有一種模型能夠完全復制出人類CP的整個病理生理過程。研究出一種更為理想的CP動物模型，可為進一步研究慢性胰腺炎提供良好的基礎。本實驗旨在初步比較并評價二乙基二硫代氨基甲酸鹽（DDC）高劑量恒量腹腔注射、DDC遞增法腹腔注射、二丁基二氯化錫（DBTC）一次性尾靜脈注射三種慢性胰腺炎胰腺纖維化造模方法，為胰腺纖維化的動物模型的制備提供更好的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料來源

SPF級雄性SD大鼠，體重180～200 g，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。二丁基二氯化錫（DBTC）購自Sigma公司，二乙基二硫代氨基甲酸鹽（DDC）購自Sigma公司，手術器械由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2 分組與造模方法

普通飼料喂養(yǎng)1周后開始實驗，實驗前12 h起禁食不禁水。按隨機數字表法將大鼠分為生理鹽水腹腔注射組（對照組）、DDC高劑量恒量腹腔注射組（DDC恒量組）、DDC遞增法腹腔注射組（DDC遞增組）、DBTC一次性尾靜脈注射組（DBTC組），每組12只。所有大鼠均喂以標準顆粒飼料，自由飲水。實驗時間為4周。對照組給予生理鹽水10 mL/（kg·次）腹腔內注射;DDC恒量組予DDC 1000 mg/（kg·次）;DDC遞增組首次給予DDC 400 mg/kg，以后每次注射的劑量在上次注射劑量的基礎上遞增10%。各組均每周注射2次，共8次，注射部位為SD大鼠右下腹外側，DBTC組予DBTC 8 mg/kg。

1.3 標本獲取與處理

末次給藥當晚大鼠禁食不禁水，次日上午空腹以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹腔靜脈取血，分離血清，用于血清學檢測，采用全自動生化分析儀檢測血淀粉酶，按試劑盒說明采用ELISA法檢測透明質酸;取胰腺組織，以4%多聚甲醛固定，逐級酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋待用。常規(guī)伊紅-蘇木素（HE）染色，對胰腺水腫、炎癥、出血、壞死進行病理評分，應用Masson染色法對胰腺膠原纖維染色。

1.4 病理評分標準

由兩位資深的病理科專科醫(yī)師通過多人共覽顯微鏡閱片，不同放大倍數全面評估，每張切片隨機選取5個高倍視野，觀察胰腺組織病理變化，根據胰腺病理評分標準[4，5]：①炎癥細胞浸潤：5個HP內均值<5個為0分，6～20個為1分，21～40個為2分，>40個為3分;②壞死：無為0分，小灶性壞死為1分，小片狀壞死為2分，大片狀壞死為3分;③結構破壞：無為0分，灶性結構破壞為1分，部分結構破壞為2分，大部分結構破壞為3分;④黏液水腫：無為0分，有為1分;⑤腺泡萎縮：無為0分，有為1分;⑥纖維化：采用Masson染色，染色結果用美國Image-Pro Plus專業(yè)彩色圖像分析軟件進行分析，在400倍視野下，選取標本四角和中央5 個視野，測定每一視野中膠原纖維含量， 以纖維占視野面積的百分比表示膠原含量， 取其平均值進行統(tǒng)計分析。5個HP內膠原纖維所占面積的均值<1.0%為0分，1.1%～5.0%為1分，5.1%～10.0%為2分，10.1%～20.0%為3分，>20.0%為4分。根據以上分值之和，0～3分為正常，4～6分為輕度CP，7～9分為中度CP，>9分為重度CP。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件包進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠存活情況

連續(xù)觀察4周，對照組大鼠全部存活，DDC恒量組36 h死亡2只，5 d、6 d各死亡1只，DDC遞增組6 d、8 d、12 d各死亡1只，DBTC組24 h死亡3只，48 h、5 d各死亡1只，DBTC組存活率低于對照組（P<0.05），其他各組間相比均無統(tǒng)計學差異（P均>0.05），見表1。

2.2 各組大鼠一般情況

對照組大鼠在整個實驗過程中，飲食、飲水、二便均未出現明顯異常，體重不斷增長，毛發(fā)有光澤，精神矍鑠，活動頻繁;DDC恒量組大鼠飲水、飲食、排尿正常，大便偏稀，脫毛，毛色光澤度欠佳，精神尚可，活動有所減少;DDC遞增組飲水略增加，進食減少，活動減少，精神萎靡，部分肢體出現震顫，毛稀疏，毛色光澤度欠佳，體重增加緩慢;DBTC組第2天開始出現倦臥、少動、食量減少、飲水增加、背毛蓬松失去光澤等，部分大鼠出現稀便、肛周污染，部分出現眼睛、鼻、爪甲出血，有時出現煩躁不安，體重緩慢增加，尾巴潰爛甚至斷落，其中死亡的大鼠共同特征為四肢消瘦，腹部膨隆，雙眼、前后爪甲黃染，尿色加深，大便陶土樣。

2.3 各組大鼠血淀粉酶、透明質酸比較

三組造模組血淀粉酶水平及透明質酸水平均顯著高于對照組（P均<0.01），其中DDC恒量組與DDC遞增組相比組間無差異，DBTC組高于其他各組（P均<0.05），見表2。

2.4 大鼠胰腺病理及膠原染色情況

2.4.1 大體觀察 ?對照組：大鼠胰腺組織飽滿，呈粉紅色，質地柔軟，表面光滑，胰膽管及血管分布規(guī)則，與周圍組織無粘連。DDC恒量組：大鼠胰腺組織輕至中度水腫，色澤略蒼白，質地稍硬，缺乏光澤，體積改變不明顯，部分胰腺有散在陳舊性出血點及點灶狀局部壞死，與周圍組織無明顯粘連。DDC遞增組：大鼠胰腺組織中至重度水腫，色澤蒼白，質地較硬，無光澤，體積縮小，表面可見局限性硬結節(jié)形成，與周圍組織物無明顯粘連。DBTC組：大鼠胰腺組織中至重度水腫，色澤蒼白，質地僵硬，無光澤，萎縮，表面廣泛硬結節(jié)形成，可見胰管、膽管擴張，腹腔內有黃色液體積聚，與脾臟或胃有粘連，其中1例14 d死亡的大鼠還可見肝膿腫形成。

2.4.2 鏡下組織學觀察 ?對照組大鼠胰腺腺泡、胰島、導管、血管、小葉間隔等結構完整，排列規(guī)則，間隔緊密，部分可見少許慢性炎細胞浸潤或是有少量充血。DDC恒量組、DDC遞增組、DBTC組大鼠均可見小葉間及小葉內有較多急慢性炎細胞浸潤，間質充血水腫明顯，小葉間隔增寬，部分可見腺泡壞死、萎縮，局部脂肪空泡樣變性、細胞核碎片沉積，并有較多纖維組織及肉芽組織增生（封三圖2）。但是以DBTC組大鼠纖維化最顯著，膠原纖維交織成網狀，呈彌漫性增生。

三組造模組病理評分、纖維化評分均顯著高于對照組（P均<0.01），其中DDC恒量組與DDC遞增組相比組間無差異， DBTC組顯著高于其他各組（P均<0.01），見表3。

3 討論

目前研究表明，慢性胰腺炎的發(fā)病原因復雜，在我國主要以膽源性疾病引起的膽管狹窄或梗阻為主[6]，而長期酗酒是歐美國家的主要病因，但是隨著人們生活方式的改變，近年來慢性酒精中毒誘發(fā)的慢性胰腺炎在我國的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[7]。CP在組織病理學上主要表現為不可逆轉的內外分泌細胞的逐漸減少、纖維化形成、導管上皮和腺上皮特有的形態(tài)學改變，其中胰腺纖維化是以大量細胞外基質沉積和分布改變?yōu)橹饕牟±韺W特征。眾所周知，慢性肝炎纖維化患者的血清透明質酸可明顯增高，同樣，在慢性胰腺炎纖維化患者中，也可以檢測到血清透明質酸升高，這是活動性炎癥導致細胞外基質動態(tài)代謝變化的標志[8]。故本實驗選取血清透明質酸指標以評估細胞外基質代謝程度。Masson染色在結締組織中是最常用的染色方法，主要區(qū)分膠原纖維和肌源纖維，因此在組織器官纖維化程度檢測中具有重要意義。胰腺外分泌障礙可出現腹脹、納差、消化不良、脂肪瀉、體重下降等臨床表現。

如何選擇較理想的CP動物模型，以便更好指導今后的研究，為更多的研究者指明方向。目前已研究出多種CP的動物模型，但是仍與人類的CP發(fā)生發(fā)展存在一定的差距。其中較成熟的造模方法有食物誘導法[9]、胰膽管注射法[10]、胰膽管結扎法[11]、腹腔注射法[12]、尾靜脈注射法[13]等，食物誘導法所需的造模周期最長，而胰膽管注射法及結扎法需要手術操作，技術含量較高，且術后并發(fā)癥較多，影響大鼠的存活率，干擾實驗結果。其中胰膽管注射有三硝基苯磺酸（TNBS）[14]。故本研究選擇幾種操作較為簡便、造模周期短、成本低廉等優(yōu)點的腹腔注射法和尾靜脈注射法進行比較。腹腔靜脈注射的藥物目前研究較多的有DDC[15]、L-精氨酸（L-arginine）[16]、雨蛙肽[17]等，尾靜脈注射的藥物較多的有DBTC[13]。本實驗研究表明DBTC組大鼠在一般情況、血淀粉酶和透明質酸水平、胰腺大體組織、病理評分和纖維化評分方面，均顯著優(yōu)于各組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），DDC遞增組與DDC恒量組相比無統(tǒng)計學差異?？梢奃DC恒量腹腔注射法和遞增腹腔注射法胰腺的纖維化不明顯，DBTC一次性尾靜脈注射法胰腺的纖維化最顯著，但不足之處是，DBTC對其他臟器也有損傷作用，如何避免急性期對胰腺外周邊臟器的損傷，減少死亡率，仍需進一步研究。DBTC是一種脂溶性物質，通過尾靜脈注射進入動物體內后，可經肝臟、膽囊排泄至胰膽管，引起胰膽管細胞壞死和上皮增生，壞死物和增生物脫落聚集，進而阻塞胰膽管，造成急性膽源性的胰腺炎，隨后轉為慢性胰腺炎，最后形成纖維化[18-20]。本實驗DBTC組大鼠出現膽管擴張腫大，腹腔內大量膽汁樣積液，身目黃染、尿黃、大便陶土色等梗阻性黃疸表現，模擬通過引起胰腺組織壞死與炎癥，造成胰腺組織損傷、修復與纖維化的過程，無論是從胰腺功能障礙，還是對胰腺病理學改變的影響，均比較符合人類CP的發(fā)病機制和病理組織學改變，因此是較為理想的CP纖維化模型。Merkord J等[13]采用DBTC一次性尾靜脈法成功復制出大鼠CP模型，觀察到CP纖維化的發(fā)展過程，成功率達80%，與本研究結果符合，此造模方法具有可復制性。

[參考文獻]

[1] 中華醫(yī)學會外科學分會胰腺外科學組.慢性胰腺炎診治指南（2014）[J]. 臨床肝膽病雜志，2015，31（3）：322.

[2] Stevens T，Conwell DL，Zuccaro G. Pathogenesis of chronic pancreatitis：An evidence-based review of past theories and recent developments[J]. Am J Gastmenterol，2004，99（11）：2256-2270.

[3] Witt H，Apte MV，Keim V，el al. Chronic pancreatitis：Challenges and advances in pathogenesis，genetics，diagnosis，and therapy[J]. Gastroenterology，2007，132：1557-1573.

[4] Zhao HF，Ito T，Gibo J，et al. Anti-monocyte chemoattractant protein-1 gene therapy attenuates experimental chronic pancreatitis induced by dibuthltin dichcoride in rats[J]. Gut，2005，54（12）：1759-1767.

[5] 柳興其，楊竹林，梁珊. DBTC誘導SD大鼠慢性胰腺炎及血清AMS、TNF-α含量測定[J]. 實用預防醫(yī)學，2007， 14（3）：682-685.

[6] 錢家鳴，李景南，田自力，等. 215例慢性胰腺炎病因學分析[J]. 胃腸病學，2001，6：153-155.

[7] 葉博，胡良皞，廖專，等. 2180例慢性胰腺炎臨床特征及治療模式變遷分析[J]. 中華消化內鏡雜志，2013，30（1）：10-14.

[8] Sparmann G，Merkord J，Jaschke A，et al. Pancreatic fibrosis in experimental pancreatitis induced by dibutyltin dichloride[J]. Gastroenterology，1997，112：1664-1672.

[9] Su SB，Motoo Y，Xie MJ，et al. Apoptosis in rat spontaneous chronic pancreatitis：Role of the fas and fas ligand system[J]. Dig Dis Sci，2001，46（1）：166-175.

[10] 王興鵬，龔自華，吳愷，等. 慢性胰腺炎動物模型的建立[J]. 胰腺病學，2001，1（1）：52.

[11] Sugimoto M，Takada T，Yasuda H. A new experimental pancreat it is by incomeplete closed duodenal loop：The influence of pancreatic microcirculation on the development and progression of induced severe pancreat it is in rats[J]. Pancreas，2004，28：e112-e119.

[12] Westerloo DJ，Florquin S，de Boer AM，et al. Therapeutic effects of troglitazone in experimental chronic pancreatitis in mice[J]. Am J Pathol，2005，166（3）：721.

[13] Merkord J，Weber H，Sparmann G，et al. The course of pancreatic fibrosis induced by dibutyhin dichloride（DBTC）[J]. Ann N Y Acad Sci，1999，880：231.

[14] Miyauchi M，Suda K，Kuwayama C，et al. Role of fibrosis-related genes and pancreatic duct obstruction in rat panereatitis models：Implications for chronic pancreatitis[J].Histol Histopathol，2007，22：1119-1127.

[15] 王昱良，鄭永青，夏時海，等. 氧化苦參堿對慢性胰腺炎胰腺組織中I型膠原及α-SMA的影響[J]. 世界華人消化雜志，2010，18（13）：1331-1336.

[16] Hu N，Shen Y，Liu F，et al. Morphological and immunobiochemical analysis of the liver in L-arginine induced experimental chronic pancreatitis[J]. Pancreatology，2017， 17（2）：247-254.

[17] Ulmasov B，Xu Z，Talkad V，et al. Angiotensin Ⅱ signaling through the AT1a and AT1b receptors does not have a role in the development of cerulein-induced chronic pancreatitis in the mouse[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2010，299（1）：G70-80.

[18] Zhang H，Liu B，Xu XF，et al. Pathophysiology of chro nic pancreatitis induced by dibutyltin dichloride joint ethanol in mice[J]. World J Gastroenterol，2016，22（10）：2960-2970.

[19] 劉芳，史迎莉，張曉芹，等. 氧化炎癥級聯反應在二氯二丁基酯聯合乙醇誘發(fā)的小鼠胰腺纖維化進展中的作用[J]. 中國應用生理學雜志，2015，31（5）：477-480.

[20] 何新紅，陸建平，廖專，等. 二丁基二氯化物尾靜脈注射建立大鼠慢性胰腺炎模型[J]. 胰腺病學，2007，7（1）：17-20.

（收稿日期：2019-11-05）