柳家翠，黃奔，許培培

1 武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢 430071；2 鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院

肺癌是世界上最常見腫瘤，由于該病早期癥狀不特異，大多數(shù)確診時(shí)已是中晚期，伴全身多處轉(zhuǎn)移，失去了最佳治療時(shí)機(jī)[1]。研究[2]表明，肺癌患者的5年生存率只有10%～20%。近年，隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)肺癌分子發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)逐漸深入，促進(jìn)了新型分子標(biāo)志物的產(chǎn)生及靶向治療的發(fā)展，改善了晚期或轉(zhuǎn)移性疾病患者的總體生存期[3]。因此，確定與肺癌密切相關(guān)的新型分子靶點(diǎn)具有重大意義，能夠?yàn)榉伟┑姆肿影邢蛑委熖峁├碚摷皩?shí)踐依據(jù)。

染色質(zhì)許可和DNA復(fù)制因子1(CDT1)基因編碼的蛋白質(zhì)參與了DNA復(fù)制所需的復(fù)制前復(fù)合物的形成，是啟動(dòng)DNA復(fù)制的關(guān)鍵因子[4,5]。正常情況下，CDT1確保每個(gè)細(xì)胞周期只復(fù)制一次，對(duì)維持基因組的穩(wěn)定性至關(guān)重要[6,7]。研究[8]表明CDT1在體內(nèi)的過表達(dá)容易導(dǎo)致DNA復(fù)制異常，同時(shí)可激活DNA損傷檢查點(diǎn)，在細(xì)胞系或動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化。CDT1在乳腺癌[9]、肝癌[10]、結(jié)腸癌[11]等癌癥中異常表達(dá)，并且與癌癥患者的預(yù)后相關(guān)，提示CDT1可作為潛在的預(yù)后預(yù)測(cè)因子。然而，關(guān)于CDT1在肺腺癌中的表達(dá)變化及意義目前仍缺乏研究報(bào)道。本研究通過下載整理癌癥基因組圖譜(TCGA) 數(shù)據(jù)庫(kù)中2019年11月20日之前納入的肺腺癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)及患者臨床信息，分析CDT1在肺腺癌中的表達(dá)變化,探討CDT1與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，并分析CDT1作用相關(guān)信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 原始數(shù)據(jù)的下載及預(yù)處理 從TCGA官方網(wǎng)站(https://portal.gdc.cancer.gov/)檢索并下載肺腺癌的表達(dá)譜數(shù)據(jù)及相應(yīng)臨床信息。其中，基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)包括肺腺癌組織樣本535例份，肺組織樣本59例份。使用Strawberry Perl 5.30.1軟件將原始基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)整理成基因表達(dá)矩陣文件，利用R 3.6.1軟件提取CDT1在肺腺癌組織樣本和正常肺組織樣本中的表達(dá)量數(shù)據(jù)。利用Strawberry Perl 5.30.1軟件和R 3.6.1軟件整理下載的肺腺癌患者臨床資料，僅保留生存時(shí)間、生存狀態(tài)、年齡、性別、Stage分期、T分期、N分期、M分期信息均完整的患者數(shù)據(jù)。

1.2 CDT1表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性分析及驗(yàn)證 以CDT1在肺腺癌患者中表達(dá)水平的中位值(4.409)為界限，將肺腺癌患者分為CDT1高表達(dá)組和CDT1低表達(dá)組。通過χ2檢驗(yàn)比較兩組臨床病理特征的差異。并根據(jù)在TCGA下載整理的肺腺癌患者的臨床信息，結(jié)合CDT1表達(dá)量，利用單因素及多因素COX分析CDT1表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理特征相關(guān)性。

利用R 3.6.1軟件“survival”包分析CDT1高、低表達(dá)組總體生存率(OS)的差異，并使用GEPIA在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)、UALCAN在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/)及Kaplan Meier-plotter在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https://kmplot.com/analysis/)對(duì)CDT1表達(dá)及生存分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。具體操作方法如下：①GEPIA分析CDT1表達(dá)及預(yù)后情況設(shè)置參數(shù)：i)表達(dá)參數(shù)：Gene：“CDT1”；Dataset： “LUAD”；Matched Normal data：“Match TCGA normal and GTEx data”，其他設(shè)為數(shù)據(jù)庫(kù)默認(rèn)條件；ii)預(yù)后參數(shù)：Gene：“CDT1”；Methods：“overall survival”；Group Cutoff： “Median”；Dataset：“LUAD”，其他為數(shù)據(jù)庫(kù)默認(rèn)條件。②Kaplan Meier-plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDT1表達(dá)與肺腺癌患者OS的關(guān)系詳細(xì)參數(shù)如下： Gene symbol: “CDT1”; survival: “OS”; Probe set options: “only JetSet best probe set”; COX regression: “multivariate”;其他條件選擇數(shù)據(jù)庫(kù)默認(rèn)條件。③UALCAN在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDT1表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后關(guān)系的設(shè)置條件：選擇“TCGA analysis”進(jìn)行分析；Enter gene symbol(s)框內(nèi)填入“CDT1”；數(shù)據(jù)集選擇“l(fā)ung adenocarcinoma”；點(diǎn)擊“survival”。

1.3 CDT1基因相關(guān)信號(hào)通路富集分析 使用GSEA3.0軟件對(duì)CDT1進(jìn)行基因富集分析。以Molecular Signature Database(MsigDB)數(shù)據(jù)庫(kù)中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集作為功能基因集進(jìn)行富集分析。將CDT1的表達(dá)水平分為高、低表達(dá)兩組。采用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法，隨機(jī)組合次數(shù)設(shè)1 000次，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件。用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析CDT1在肺腺癌組織和肺正常組織樣本中的表達(dá)差異；對(duì)CDT1表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；單因素及多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型用于評(píng)價(jià)CDT1與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系；生存分析使用Kaplan-Meier法，生存曲線比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織、正常肺組織CDT1基因的表達(dá)水平比較 CDT1在肺腺癌組織表達(dá)水平(CDT1Mean=5.414)高于正常肺組織(CDT1Mean=0.734)(P<0.001)(圖 1A)。在57對(duì)配對(duì)的肺腺癌組織(CDT1Mean=5.005)與癌旁正常組織(CDT1Mean=0.726)樣本中，腫瘤組織CDT1表達(dá)水平較癌旁正常肺組織也顯著上調(diào)(P<0.001)(圖 1B)。

注：A圖為TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集中，CDT1在正常肺組織和肺腺癌組織中的表達(dá)比較；B為在TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集中，57對(duì)配對(duì)的肺癌組織和癌旁組織中CDT1的表達(dá)比較。

2.2 肺腺癌組織CDT1基因表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系 肺腺癌組織中CDT1基因表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系見表1。肺腺癌組織中CDT1表達(dá)量與年齡(P=0.019)、性別(P=0.049)、Stage分期(P=0.007)、M分期(P=0.042)顯著相關(guān)。單因素COX分析結(jié)果顯示，Stage分期、T分期、N分期和CDT1均可以作為肺腺癌潛在的預(yù)后因素(P均<0.001)；多因素COX回歸分析結(jié)果提示，Stage分期(HR=1.97, 95%CI: 1.22-3.17,P=0.005)和CDT1(HR=1.43, 95%CI: 1.14～1.79,P=0.002)可以作為肺腺癌的獨(dú)立預(yù)后影響因素(見表2)。

2.3 CDT1與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系以及在線工具驗(yàn)證結(jié)果 CDT1高表達(dá)與肺腺癌患者不良預(yù)后有關(guān) (P=0.029)(見圖2A)。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)在線驗(yàn)證結(jié)果顯示CDT1在肺腺癌組織中高表達(dá)且CDT1低表達(dá)組OS高于高表達(dá)組(P=0.001 9)(圖2B)； Kaplan Meier-plotter 在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明，高表達(dá)組肺腺癌患者的OS較低(HR=2.15, 95%CI1.81～2.54,P<0.001)(圖2C)；UALCAN在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果也顯示CDT1高表達(dá)的肺腺癌患者具有較低的OS(P=0.004)(圖2D)。

表1 肺腺癌組織CDT1基因表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

表2 肺腺癌患者單因素和多因素COX回歸分析結(jié)果

注：A為TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù) ；B分別為GEPIA在線數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)；C為Kaplan Meier-plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)。

2.4 CDT1基因相關(guān)信號(hào)通路 CDT1基因高表達(dá)樣本主要富集在細(xì)胞周期、嘌呤與嘧啶代謝、RNA降解、核苷酸切除修復(fù)以及P53信號(hào)通路中，詳見表3。

表3 CDT1基因GSEA功能富集分析結(jié)果

3 討論

DNA復(fù)制是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵步驟。正常情況下，DNA復(fù)制的整個(gè)過程均受到體內(nèi)分子網(wǎng)絡(luò)的嚴(yán)密調(diào)控，以確保機(jī)體進(jìn)行正常的細(xì)胞增殖。DNA復(fù)制錯(cuò)誤造成的DNA損傷可導(dǎo)致癌轉(zhuǎn)化、發(fā)育障礙和衰老[12]。DNA復(fù)制起點(diǎn)許可是控制細(xì)胞分裂和基因組完整性的一個(gè)進(jìn)化保守步驟，該步驟主要是由微脂質(zhì)體維持(MCM)解旋酶復(fù)合物的DNA裝載的。CDT1蛋白是真核細(xì)胞的DNA復(fù)制起點(diǎn)許可過程中必不可少的組分。CDT1可與ORC和CDC6協(xié)同作用，招募并參與解旋酶MCM的核心裝載[7]。因此，CDT1的任何異常都可能導(dǎo)致DNA復(fù)制過程出錯(cuò)，從而激活DNA損傷檢查點(diǎn)誘發(fā)機(jī)體的惡性轉(zhuǎn)化[13]。

Arentson等[14]在一種永生化的原始紅細(xì)胞系中，通過整合逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA激活了CDT1，他們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CDT1的NIH3T3細(xì)胞能夠在Rag2-/-小鼠中形成腫瘤，由此鑒定CDT1是一種潛在的致癌基因。Bravou等[11]通過免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤性結(jié)腸上皮相比，結(jié)直腸癌灶內(nèi)CDT1蛋白表達(dá)增強(qiáng)。另有研究者指出，在肝細(xì)胞癌中CDT1的過表達(dá)與DNA損傷反應(yīng)有關(guān)，而且CDT1的過表達(dá)與腫瘤分級(jí)以及TNM分期顯著相關(guān)，是肝細(xì)胞癌的重要預(yù)后生物標(biāo)志物[10]。這些研究均表明了CDT1在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色。Karakaidos等[15]報(bào)道了在非小細(xì)胞肺癌的一個(gè)亞群中，CDT1顯著過表達(dá)，且與CDC6水平呈正相關(guān)，并且CDT1及CDC6的過表達(dá)與p53的突變一致，說明CDT1過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞過度復(fù)制，同時(shí)可影響染色體的穩(wěn)定性，然而該研究并未具體分析CDT1在肺腺癌患者中的表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系。

正常情況下，CDT1受到多種機(jī)制的負(fù)性調(diào)控，一旦解除對(duì)CDT1的調(diào)控可導(dǎo)致染色體損傷，從而導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定性，進(jìn)一步誘發(fā)正常細(xì)胞突變成腫瘤[16]。本研究利用生信挖掘的方法，通過下載并分析TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，CDT1在肺腺癌組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào)。同時(shí)有研究[17]顯示，CDT1是腫瘤發(fā)展與發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要因素。本研究通過χ2檢驗(yàn)分析驗(yàn)證了CDT1表達(dá)水平與患者的Stage分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性，多因素COX回歸分析提示CDT1可作為肺腺癌的獨(dú)立預(yù)后因子。 另有研究[18]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因過表達(dá)CDT1的模型小鼠生存期不超過兩周，顯著低于正常小鼠。本研究的生存分析以及在線工具驗(yàn)證結(jié)果也表明CDT1高表達(dá)的肺腺癌患者總體生存率較差。GSEA功能富集分析預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CDT1可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和與致癌信號(hào)相關(guān)的通路，但其參與調(diào)節(jié)的具體生物學(xué)信號(hào)通路仍有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。由此可見，CDT1基因表達(dá)水平的變化對(duì)肺腺癌發(fā)生發(fā)展具有顯著影響。

綜上所述， CDT1在肺腺癌患者中高表達(dá)，與肺腺癌患者的Stage分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等相關(guān)，可作為導(dǎo)致肺腺癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，并通過參與多種信號(hào)通路促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究的局限性在于僅從生物信息學(xué)角度對(duì)CDT1在肺腺癌組織中的表達(dá)變化及與患者臨床病理特征、預(yù)后相關(guān)性和信號(hào)通路等進(jìn)行分析，而缺乏CDT1參與肺腺癌發(fā)生發(fā)展的體內(nèi)外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)。因此，接下來應(yīng)通過具體相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本研究中的生信分析研究結(jié)果，從而為將來CDT1作為肺腺癌治療的分子靶點(diǎn)提供更多臨床線索及證據(jù)。