鄒德堂，韓 笑，孫 健，王敬國(guó)，劉化龍，鄭洪亮，楊洛淼，荊雨桐，黃 菊

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

水稻是重要的糧食作物，隨人民生活水平和糧食產(chǎn)量提高，稻米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)倍受關(guān)注。維生素是衡量水稻營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，也是人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。B 族維生素作為維生素家族的重要成員，有12 種以上，被世界公認(rèn)的有9 種，均為輔酶，參與人體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪和糖類(lèi)等代謝。B 族維生素有助于維持心臟、神經(jīng)系統(tǒng)功能、消化系統(tǒng)及皮膚健康，參與能量代謝。

維生素B1 改變坐骨神經(jīng)組織中乙酰膽堿酯酶含量和NF-kappa B 表達(dá)，從而預(yù)防和改善神經(jīng)病變[2]。VB1、VB2 可調(diào)節(jié)性激素水平，縮短子宮出血時(shí)間，對(duì)治療功能性子宮出血效果明顯且安全性高[3]。VB2 可通過(guò)自身抗氧化性和Nrf2 通路激活防止ros 誘導(dǎo)阿爾茨海默癥發(fā)生[4]。VB6 輔酶形式（PLP）可通過(guò)增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能和延緩腫瘤發(fā)展進(jìn)而對(duì)癌癥發(fā)揮抑制作用[5]。生物素通過(guò)減少NF-kM 激活，防止炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，維護(hù)腸道黏膜完整[6]。葉酸、VB12、葉酸聯(lián)合VB12 治療可降低糖尿病患者血中Hcy 水平[7]。VB12 缺乏可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷，易怒、記憶力下降等癥狀[8]。Ehm?edah 等認(rèn)為 B 族維生素在 PNI 后 M1/M2 過(guò)渡過(guò)程中發(fā)揮作用且具有治療神經(jīng)炎癥和神經(jīng)再生的潛力[9]。

B族維生素是維持人體正常機(jī)能與代謝活動(dòng)不可或缺的水溶性維生素，人體無(wú)法合成必須額外補(bǔ)充。研究水稻中B 族維生素含量，發(fā)掘富含B族維生素種質(zhì)資源對(duì)從水稻中獲取更多維生素B具有重要意義。已有研究表明，紅米與紫米富含氨基酸、蛋白質(zhì)、植物脂肪、纖維素、人體必需礦質(zhì)元素及豐富的維生素B1、B2、B3、B6、B12等[10]。

王艷等研究發(fā)現(xiàn)，糙米、胚芽米和精白米中維生素B 含量呈由高到低趨勢(shì)[11]。韓磊等研究表明，紫、黑糙米中VB1、VB2 含量為白糙米1.5～6.8 倍[12]。趙騰芳等研究認(rèn)為黑米中VB1 和VB2 含量高于白米[13]。吳國(guó)泉等研究表明舟山紅米中VB1 和VB2 含量顯著高于浙733[14]。顧德法等研究表明紫黑糯稻中VB2 含量顯著高于普通稻米[15]。以往研究集中于分析有色稻米與普通稻米VB1 及VB2，本研究首次比較不同種皮顏色稻米間多種維生素B，以期為稻米B 族維生素相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

本研究以來(lái)源地不同89 份水稻品種為試驗(yàn)材料，測(cè)定其糙米中VB1、VB3、VB5、VB6、VB7和VB9含量，篩選出高富含B族維生素品種，為培育優(yōu)質(zhì)新品種提供親本材料，也為水稻功能營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)基因挖掘奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

89份水稻品種來(lái)源如表1所示，其中無(wú)色種皮稻米33份、白色種皮稻米11份、黑色種皮稻米14份、紅色種皮稻米22 份、紫色種皮稻米9 份。試驗(yàn)材料于2019 年種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)與示范阿城基地，4月中旬播種，5月中旬移栽，試驗(yàn)地設(shè)計(jì)為插秧密度30 cm×10 cm，行長(zhǎng)3m，四行區(qū)，3次重復(fù)，田間管理同一般大田管理。種子收獲后，經(jīng)晾曬使其理化性質(zhì)穩(wěn)定。糙米機(jī)脫殼得到糙米，磨成糙米粉后過(guò)60目篩，測(cè)定6種B族維生素含量。

1.2 B族維生素含量測(cè)定

B族維生素含量測(cè)定方法根據(jù)李江方法稍作修改[16]。樣本處理：稱(chēng)取100 mg 米粉于2 mL 離心管中，加入1 mL PBS 試劑，以2 000 r·min-1離心20 min，收集上清液，4 ℃保存。將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡70 min，取出酶標(biāo)包被板，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣品孔和空白孔；在標(biāo)準(zhǔn)品孔中分別加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，在樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，再加樣品10 μL（樣品最終稀釋5倍）。

除空白孔外每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，封板膜封板后置于37 ℃溫育60 min。去掉封板膜，將酶標(biāo)包被板液體甩干，每孔加入適量洗滌液，每隔30 s 洗滌1 次，重復(fù)5 次后拍干。每孔先加入50 μL顯色劑A，再加入50 μL顯色劑B，震蕩使其混勻，置于37 ℃下避光顯色15 min。顯色時(shí)間結(jié)束后向每孔中加入終止液50 μL（最終顏色為黃色）。以空白孔調(diào)零，利用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)A450處依序測(cè)定每孔OD值。

1.3 定量分析方法

采用Excel 2007 軟件處理數(shù)據(jù)，利用SPSS 24軟件分析結(jié)果。該試劑盒標(biāo)示靈敏度為10 pg·mL-1，變異系數(shù)小于10%。根據(jù)實(shí)際測(cè)定OD值與稀釋倍數(shù)換算后得出最終檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 有色稻米與無(wú)色稻米6種B族維生素含量分析

通過(guò)分析56 份有色稻米和33 份無(wú)色稻米VB1、VB3、VB5、VB6、VB7 和 VB9 含量，表2由可知，有色稻米和無(wú)色稻米6種B族維生素含量依次為VB6>VB1>VB9>VB5>VB3>VB7，除VB7 外，其他5種B族維生素含量在有色稻米和無(wú)色稻米間差異均達(dá)顯著（見(jiàn)表3），其中VB1和VB9差異極顯著。有色稻米 VB1、VB3、VB5、VB6 和 VB9 含量均高于無(wú)色稻米，有色稻米VB1、VB3、VB5、VB6 和 VB9 含量平均值為 3 452.79、18.42、28.51、14 805.84 和 47.13 ng·g-1；無(wú)色稻米為 2 699.78、16.33、26.15、12 778.70 和 43.47 ng·g-1。由此可知，有色稻米富含VB1、VB3、VB5、VB6 和VB9等B族維生素。

表2 有色稻米和無(wú)色稻米VB1、VB3、VB5、VB6、VB7和VB9等B族維生素含量分析Table 2 B vitamin content analysis of VB1,VB3,VB5,VB6,VB7 and VB9 in colored and colorless rices

表3 有色稻米和無(wú)色稻米6種B族維生素含量方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of six kinds of B vitamin contents in colored and colorless rices

2.2 不同種皮顏色稻米6種B族維生素含量分析

通過(guò)分析白、黑、紅和紫等4種不同種皮顏色稻米 VB1、VB3、VB5、VB6、VB7 和 VB9 含量，由表4可知，不同種皮顏色稻米VB1含量依次為黑>紫>紅>白；VB3 和 VB9 含量依次為紫>黑>紅>白；VB5含量依次為黑>紅>紫>白；VB6含量依次為黑>紫>白>紅；VB7 含量依次為黑>白>紅>紫；VB1、VB5、VB6 和VB9 含量不同種皮顏色稻米間差異均達(dá)顯著，VB3和VB7不同種皮顏色稻米間差異不顯著（見(jiàn)表5）。

表4 不同種皮顏色稻米6種B族維生素含量分析Table 4 Analysis of six kinds of B vitamin contents in different seed coat color rice

表5 不同種皮顏色稻米6種B族維生素含量方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis of six kinds of B vitamin contents in different seed coat color rices

通過(guò)比較不同種皮顏色稻米VB1、VB3、VB5、VB6、VB7 和VB9 含量，結(jié)果表明，白色種皮稻米中VB1、VB3、VB5和VB9含量最低，分別為3 001.13、17.38、24.74 和 42.63 ng·g-1；VB6 僅高于紅色種皮稻米為14 434.97 ng·g-1；VB7 含量為17.19 ng·g-1與黑色種皮稻米17.20 ng·g-1接近且高于種皮顏色為紅色和紫色稻米。黑色種皮稻米中VB1、VB5、VB6和VB7含量最高，分別為3 870.03、31.13、16 442.88和17.20 ng·g-1；VB3含量為19.05 ng·g-1與紫色種皮稻米19.71 ng·g-1接近且高于種皮顏色為紅色和白色稻米。紅色種皮稻米中VB1 和VB3含量?jī)H高于白色種皮稻米，分別為3 340.74和18.01 ng·g-1；VB5 含量?jī)H次于黑色種皮稻米為29.19 ng·g-1；VB6 含量最低為 13 763.76 ng·g-1；VB7含量?jī)H高于紫色種皮稻米為15.14 ng·g-1；VB9含量?jī)H高于白色種皮稻米為45.98 ng·g-1。紫色種皮稻米VB3 和VB9 含量最高，分別為19.71 和51.56 ng·g-1；VB1 和 VB6 含量?jī)H次于黑色種皮稻米，分別為 3 629.69 和 15 259.92 ng·g-1；VB5 含量?jī)H高于白色種皮稻米為27.40 ng·g-1；VB7含量最低為14.74 ng·g-1。由此可知，黑色種皮稻米富含VB1、VB5、VB6 和VB7，紅色種皮稻米富含VB5，紫色種皮稻米富含VB3和VB9，白色種皮稻米富含VB7。

2.3 水稻富含B族維生素品種篩選

利用分位數(shù)法篩選89 份水稻品種中VB1、VB3、VB5、VB6、VB7和VB9等6種B族維生素含量，采用百分位數(shù)分別為90和10篩選各種維生素B含量品種（見(jiàn)表6）。

樣品中巨胚清香糯VB1 含量最高，富士光最低，10 個(gè)VB1 含量高品種VB1 含量平均值為4 508.46 ng·g-1，VB1 含量顯著高于其他品種；樣品中稻花香VB3 含量最高，降糖稻最低，10 個(gè)VB3 含量高品種 VB3 含量平均值為 24.83 ng·g-1，VB3 含量顯著高于其他品種；樣品中紅皮米VB5含量最高，越光最低，10 個(gè)VB5 含量高品種VB5含量平均值為36.19 ng·g-1，VB5 含量顯著高于其他品種；樣品L-2 中VB6 含量最高，D109 最低，10 個(gè)VB6 含量高品種VB6 含量平均值為18 494.09 ng·g-1，VB6 含量顯著高于其他品種；樣品巨樓中VB7 含量最高，元子粘稻最低，10 個(gè)VB7 含量高品種 VB7 含量平均值為 22.50 ng·g-1，VB7 含量在試驗(yàn)材料中顯著高于其他品種；樣品EB139 中的VB9 含量最高，綏紅香最低，10 個(gè)VB9 含量高品種 VB9 含量平均值為 58.28 ng·g-1，VB9 含量顯著高于其他品種。

巨胚清香糯為高VB1 高VB6 品種，紅皮米為高 VB1、VB5 品種，紫稻 3 號(hào)和西紅-2 為高 VB1、VB3 品種，紅殼米為高 VB1、VB9 品種，EB139 和小黑稻為高VB3、VB9 品種，2013 為高VB3、VB5品種，一展紅-1為高VB5、VB9品種，早黑2號(hào)為高 VB6、VB9 品種。黑稻-6 為高 VB3、VB5、VB7品種，尚州粘為高VB3、VB5、VB6品種。

表6 B族維生素高含量及低含量品種Table 6 High content and low content varieties of B vitamin

4 討論與結(jié)論

B族維生素對(duì)人體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、糖類(lèi)等代謝發(fā)揮重要作用，是維持人體正常生長(zhǎng)發(fā)育不可或缺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。B族維生素對(duì)一些疾病的治療與控制具有積極作用，沙靜等研究認(rèn)為維生素B1 口服聯(lián)合甲鈷胺注射對(duì)糖尿病周?chē)窠?jīng)病變治療效果顯著[17]。單美榮研究發(fā)現(xiàn)維生素B6 可抑制LPS誘導(dǎo)的急性肺部炎癥[18]。Wang 研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充葉酸可顯著降低冠心病患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[19]。因此，研究B族維生素對(duì)解決生活中實(shí)際問(wèn)題極為重要。目前，測(cè)量B族維生素方法有紫外分光光度法[20]、熒光光度法[21]、高效液相色譜法[22]、微生物法[23]和酶聯(lián)免疫法[16]，其中以高效液相色譜法最為常見(jiàn)[24-25]。本研究在相同環(huán)境條件下，用酶聯(lián)免疫法測(cè)定56 份有色稻米和33 份無(wú)色稻米中VB1、VB3、 VB5、 VB6、VB7 和 VB9 等 B 族 維生 素 含量。結(jié)果表明除維生素B7 外，其他5 種B 族維生素含量在有色稻米與無(wú)色稻米間差異顯著，且有色稻米B族維生素含量高于無(wú)色稻米B族維生素含量，與韓磊、趙騰芳研究結(jié)果一致[12-13]。糙米B 族維生素含量依次為VB6>VB1>VB9>VB5>VB3>VB7。

目前，對(duì)稻米B族維生素與種皮顏色相關(guān)研究較少，韓龍植等研究認(rèn)為有色種皮與普通稻米或其他特殊性狀聚合，可提高營(yíng)養(yǎng)成分含量[26]。本研究對(duì)比白、黑、紅和紫等4種不同種皮顏色稻米中維生素B1、B3、B5、B6、B7和B9含量，研究該6種B 維生素含量與種皮顏色之間關(guān)系。結(jié)果表明，VB1、VB5、VB6 和VB9 含量在不同種皮顏色稻米間差異均達(dá)顯著，VB3和VB7在不同種皮顏色稻米間差異不顯著。由此可知，VB1、VB5、VB6 和VB9含量與種皮顏色相關(guān)，而VB3和VB7含量與種皮顏色相關(guān)性弱，黑色種皮稻米富含VB1、VB5、VB6和VB7，紅色種皮稻米富含VB5，紫色種皮稻米富含VB3和VB9，白色種皮稻米富含VB7。

關(guān)于提高稻米營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量研究較多，已培育高富含品種。趙則勝等育成巨胚稻6601 中VB1和VB2含量顯著高于普通粳稻[27]。南鐘浩等以國(guó)內(nèi)外收集的特種稻資源為親本材料，育成龍錦1 號(hào)、紅香1 號(hào)、紅糯1 號(hào)、黑糯1 號(hào)、巨胚清香糯等一系列水稻品種[28]。分析上述特種稻種質(zhì)資源營(yíng)養(yǎng)含量表明其蛋白質(zhì)、賴(lài)氨酸、脂肪、維生素B1、維生素B2、微量元素等含量明顯高于對(duì)照品種[29]。本研究利用分位數(shù)法篩選89份水稻品種6種B族維生素含量，高富含品種可作為親本培育高維生素B含量?jī)?yōu)良品種，同時(shí)為提高稻米B族維生素含量研究奠定基礎(chǔ)。