徐濱，朱祥云，魏開金*，徐進，馬寶珊，王寧、2

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護重點實驗室，湖北 武漢 430223； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 湖北 武漢 430070)

拉薩裂腹魚SchizothoraxwaltoniRegan隸屬于鯉形目Cypriniformes鯉科Cyprinidae裂腹魚亞科Schizothoracinae裂腹魚屬Schizothorax，又稱為貝氏裂腹魚、拉薩弓魚、尖嘴魚，主要分布在雅魯藏布江米林至日喀則江段的干、支流，是中國的特有魚類，也是西藏地區(qū)的主要經(jīng)濟水產(chǎn)動物[1]，具有重要的研究價值。拉薩裂腹魚是比較典型的適應(yīng)流水環(huán)境的魚類，主要在河道或峽谷比較湍急的河流中生存，而水電站等設(shè)施的建設(shè)會導(dǎo)致水體的流動性減緩，從而直接威脅拉薩裂腹魚的生存及其漁業(yè)資源的可持續(xù)開發(fā)和利用。目前，漁業(yè)中過度捕撈的現(xiàn)象仍然較為嚴重，尤其在一些人口聚集、經(jīng)濟較發(fā)達地區(qū)，像雅魯藏布江干流中游區(qū)域，尼洋河、拉薩河等支流水域已捕撈過量，同時出現(xiàn)漁獲物小型化的現(xiàn)象。據(jù)報道，以往拉薩裂腹魚漁獲物個體較大，多在500 g/尾以上，但近幾年在調(diào)查發(fā)現(xiàn)，拉薩、山南和林芝等處市場大多數(shù)拉薩裂腹魚為200～300 g/尾，表明該魚的資源已開始衰退，亟須加強對漁業(yè)資源的管理。

目前，對拉薩裂腹魚開展的研究較少，早期僅涉及其分類[2-3]、起源與演化[4]等的研究報道。近年來，隨著西藏經(jīng)濟的發(fā)展，有關(guān)拉薩裂腹魚的研究增多，主要包括系統(tǒng)發(fā)育與分布等方面[5-6]，其生物學(xué)研究資料僅見于年齡與生長[7]及簡單的食性組成分析[8]，限制了其種群資源的合理利用和保護。為保護其種群資源，本課題組于2016年開始了對拉薩裂腹魚開展人工馴養(yǎng)工作，2018年人工繁殖拉薩裂腹魚獲得了成功。本研究中，通過觀察和研究拉薩裂腹魚胚胎、仔稚魚的發(fā)育形態(tài)和生長，探明其早期發(fā)育階段的特征和規(guī)律，旨在為拉薩裂腹魚的規(guī)模化人工繁育和資源保護提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用拉薩裂腹魚親魚于2018年2—5月捕自雅魯藏布江流域，其中，雌魚全長為46.4～62.8 cm，體質(zhì)量為749.6～1874.6 g，雄魚全長為35.2～52.4 cm，體質(zhì)量為386.8～1125.3 g。

1.2 方法

1.2.1 催產(chǎn)受精 試驗于2018年3—9月在四川省水產(chǎn)研究所臥龍基地進行，使用絨毛膜促性腺激素(HCG)、地歐酮(DOM)和促黃體生成素釋放激素類似物(LRH-A2)3種藥物進行人工催產(chǎn)。人工催產(chǎn)采用兩針注射法，時間間隔24 h。授精方式為人工干法受精。試驗共催產(chǎn)3批，其中，雌魚26尾、雄魚12尾，本研究中選取受精效果最好的一批受精卵用于胚胎發(fā)育的觀察、記錄和拍照，以及不同水溫對胚胎發(fā)育的影響試驗。

1.2.2 胚胎和仔稚魚的培育 孵化框的規(guī)格為25 cm×30 cm，孵化用水為從上游導(dǎo)入過濾后的溶洞水，水質(zhì)清澈，試驗期間水溫恒定為(13±1)℃，氣泵24 h充氣，水體溶解氧>7.0 mg/L。試驗期間及時用虹吸法吸出死卵和死魚。

1.2.3 早期發(fā)育觀察及分析 用體式解剖鏡(Olympus SZ61 )和顯微鏡(CX41)對胚胎和仔稚魚發(fā)育的形態(tài)特征進行觀察和拍照。為便于觀察和測量，用胰蛋白酶對部分受精卵進行去膜處理，同時用MS-222對仔魚麻醉，用ToupView軟件測量卵徑，以及仔稚魚全長、體長、頭長、肛后長等指標。每次隨機取30粒受精卵和10尾仔魚，記錄形態(tài)特征和時間。

1.2.4 不同水溫下胚胎發(fā)育比較 試驗設(shè)置13、17、21、25 ℃ 4個溫度組，用溫控加熱棒控溫，觀察不同水溫下胚胎發(fā)育的變化，記錄受精率、原腸期時間、孵化時間、出膜率、畸形率等指標。

1.2.5 積溫的計算 胚胎發(fā)育的總積溫為所有發(fā)育階段的積溫相加(h·℃)，各發(fā)育階段積溫計算公式為

積溫(h·℃)=該發(fā)育階段持續(xù)的時間(h)×該發(fā)育階段的平均水溫(℃)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拉薩裂腹魚胚胎發(fā)育過程

拉薩裂腹魚受精卵為黃色沉性卵，卵徑為(2.53±0.10)mm，吸水膨脹后卵周隙擴大，卵徑為(3.49±0.12)mm，卵黃直徑為(2.47±0.11)mm，卵黃周隙為(0.59±0.05)mm。

拉薩裂腹魚胚胎發(fā)育可分為受精卵期、胚盤期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期和出膜期，共8個階段33個時期(表1，圖1)。在(13±1)℃水溫條件下，胚胎從受精卵到孵化出膜歷時225 h 10 min，積溫為2838.79 h·℃。其中，受精卵的持續(xù)時間為3 h 20 min，積溫為43.33 h·℃；卵裂期的持續(xù)時間為9 h 30 min，積溫 126.23 h·℃；囊胚期和原腸期的持續(xù)時間分別為16 h 56 min、19 h 26 min，積溫分別為220.13、206.76 h·℃；神經(jīng)胚期持續(xù)12 h 53 min，積溫為167.49 h·℃；器官分化期持續(xù)97 h 56 min，積溫為1257.99 h·℃；出膜期持續(xù)65 h 19 min，積溫為816.88 h·℃(表1)。

續(xù)表1 拉薩裂腹魚胚胎發(fā)育特征描述Cont.Tab.1 Embryo development features of Schizothorax waltoni Regan

2.2 不同水溫下胚胎發(fā)育比較

從表2可見：拉薩裂腹魚的胚胎發(fā)育隨著水溫的升高，達到原腸期和孵化的時間均明顯縮短，孵化時間由13 ℃時225 h 10 min縮短至17 ℃時145 h 25 min和21 ℃時112 h 10 min，同時，受精率和出膜率均有不同程度的降低，畸形率則大幅上升。至25 ℃，胚胎完全無發(fā)育。

表2 水溫對拉薩裂腹魚胚胎發(fā)育的影響Tab.2 Effects of water temperature on embryo development of Schizothorax waltoni regan

2.3 拉薩裂腹魚仔稚魚發(fā)育特征

從圖2可見：仔魚初孵時眼囊較大，未見黑色素；在耳石后方的胸鰭較??；卵黃前部呈近橢圓形，后部為細長狀，肛凹明顯；心臟及卵黃網(wǎng)狀靜脈呈淡紅色，頭、軀干尾部微觀察到紅色，血液循環(huán)明顯；仔魚靜臥于水底，尾部偶爾擺動(圖2-A)。1日齡仔魚晶體出現(xiàn)黑色素，胸鰭舒展呈半圓形，未發(fā)現(xiàn)口凹(圖2-B)。2日齡仔魚，眼囊內(nèi)充滿黑色素，卵黃囊變成長柱形；可見口凹，但未見口裂；鰓弓原基出現(xiàn)，未見鰓蓋活動，可見鰓部有血液流動(圖2-C)。3日齡仔魚，出現(xiàn)鼻凹，卵黃減小呈細條狀，運動能力變強(圖2-D)。4日齡仔魚出現(xiàn)口裂(圖2-E)。 5日齡仔魚，鰓蓋有微微張合，在顯微鏡下可觀察到鰓絲，頭和身體出現(xiàn)黑色素，胸鰭變大但未見鰭條(圖2-F)。8日齡仔魚，背部黑色素增多，同時在腹部出現(xiàn)黑色素；卵黃繼續(xù)減少，魚體分布血管呈網(wǎng)狀；尾椎微上翹；背鰭分化，可短時平游(圖2-G)。9日齡仔魚，出現(xiàn)尾鰭條雛形，口張合閉合的速度加快，腸道已經(jīng)貫通(圖2-H)。11日齡仔魚消化道清晰，第一鰾室出現(xiàn)(圖2-I)。16日齡仔魚，出現(xiàn)背鰭鰭條，腹部鰭褶延伸至胸鰭后緣，臀鰭開始分化(圖2-J)。18日齡仔魚，腹鰭原基出現(xiàn)(圖2-K)。20日齡仔魚，尾鰭開始分叉(圖2-L)。23日齡仔魚，臀鰭鰭條出現(xiàn)，卵黃囊消失(圖2-M)。

25日齡仔魚，第二鰾室出現(xiàn)(圖2-N)。70日齡仔魚的側(cè)線已發(fā)育完全，各鰭也已長成，魚體顏色和體型接近于成魚，成為幼魚(圖2-O)。

2.4 拉薩裂腹魚卵黃囊仔魚階段的生長

從表3可見：拉薩裂腹魚仔魚初孵時全長為(10.71±0.29)mm，肛后長為(3.01±0.02)mm；卵黃囊被完全吸收時，仔魚全長為(18.35±0.65)mm，增加了71.34%;1～7日齡仔魚生長較快速，從8日齡開始，生長幅度減緩，至20日齡時仔魚生長幅度又開始加快;仔魚頭長與全長比及肛后長與全長比均呈遞增趨勢。

表3 拉薩裂腹魚早期仔魚的生長情況Tab.3 Growth of Schizothorax waltoni Regan during post-embryonic development

3 討論

3.1 拉薩裂腹魚與其他裂腹魚亞科魚類的胚胎發(fā)育比較

將拉薩裂腹魚與裸鯉屬的松潘裸鯉[9]、硬刺松潘裸鯉[10]、青海湖裸鯉[11]，尖裸鯉屬尖裸鯉[12]，扁吻魚屬扁吻魚[13]，裂腹魚屬的短須裂腹魚[14]、齊口裂腹魚[15]、四川裂腹魚[16]、小裂腹魚[17]等其他裂腹魚亞科魚類早期發(fā)育特點進行比較(表4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，拉薩裂腹魚的受精卵在幾種裂腹魚中略大，卵周隙也較大，為微黏、沉性卵。雖然初孵仔魚的大卵黃會減弱仔魚的游泳能力，但可以為仔魚提供更多營養(yǎng)物質(zhì)，從而延長仔魚由內(nèi)源性營養(yǎng)向外源性營養(yǎng)轉(zhuǎn)變的時間，有助于仔魚開口后完成初次攝食，提高仔魚的存活率。肌節(jié)的分化時間，僅尖裸鯉出現(xiàn)在胚孔封閉期前，其余9種魚的肌節(jié)均出現(xiàn)在胚孔封閉后分化；魚體色素的出現(xiàn)時間，拉薩裂腹魚與硬刺松潘裸鯉、松潘裸鯉、青海湖裸鯉、齊口裂腹魚相同，均在孵化后1 d出現(xiàn)，扁吻魚、四川裂腹魚、短須裂腹魚則在孵化后2 d出現(xiàn)，出現(xiàn)最遲的是尖裸鯉在孵化后3 d出現(xiàn); 胸鰭原基出現(xiàn)時間，拉薩裂腹魚、尖裸鯉、硬刺松潘裸鯉是在孵化前出現(xiàn)，其余在孵化后出現(xiàn)，這可能與孵化水溫和孵化時長有關(guān)，在低水溫下胚胎發(fā)育時間較長，胸鰭原基得以分化；出膜方式，拉薩裂腹魚、硬刺松潘裸鯉、扁吻魚及齊口裂腹魚為頭部或尾部出膜，其余為尾部出膜；出膜時發(fā)育階段，拉薩裂腹魚、尖裸鯉、硬刺松潘裸鯉為胸鰭原基形成期，四川裂腹魚、短須裂腹魚、小裂腹魚和青海湖裸鯉為心臟搏動期，齊口裂腹魚、松潘裸鯉、扁吻魚為血液形成期。

表4 拉薩裂腹魚與其他裂腹魚亞科魚類胚胎發(fā)育特點比較Tab.4 Comparison of the embryonic developmental characteristics between Schizothorax waltoni Regan and other Schizothoracinae fish

拉薩裂腹魚主要分布在青藏高原雅魯藏布江流域，由于該區(qū)域的地層皺褶斷裂，水系不通導(dǎo)致了魚類的地理隔離和生殖隔離，物種的分化明顯。同時該地區(qū)空氣干燥稀薄，有較強太陽的輻射，晝夜溫差比較大，全年的氣溫均較低，對魚類的形態(tài)和生理代謝等均有較大的影響[18]。拉薩裂腹魚胚胎發(fā)育過程中，心臟及血液循環(huán)均出現(xiàn)較早，同時尾部鰭褶和胸鰭原基均在孵化前形成，能更好地適應(yīng)高原貧營養(yǎng)及低水溫環(huán)境。

3.2 拉薩裂腹魚仔魚發(fā)育及生長

一般認為，卵黃囊仔魚是從孵化到卵黃吸盡，并開始外源性營養(yǎng)階段，該階段仔魚歷經(jīng)各器官如眼、耳、鰓、消化道的發(fā)育與進一步完善過程；對外營養(yǎng)仔魚從背鰭分化到各鰭形成階段，鰭褶逐漸分化出鰭條，骨骼鈣化，游泳和攝食能力增強，從內(nèi)源性營養(yǎng)轉(zhuǎn)化為完全外源性營養(yǎng)[19]。拉薩裂腹魚仔魚孵化后前6 d生長速度較快，同時，仔魚吸收卵黃囊的速度也較快，卵黃囊由初孵時的棒槌狀變?yōu)榧毎魻?，口、鰓、胸鰭等在出膜后5 d快速分化和生長。孵化后8～9 d腸道形成，仔魚攝食少量人工餌料，進入混合營養(yǎng)期。孵化后13 d仔魚的卵黃已完全吸收，攝食頻率增多、強度加大。隨后仔魚的背鰭、尾鰭、腹鰭、臀鰭陸續(xù)開始分化。仔稚魚從內(nèi)源營養(yǎng)向外源營養(yǎng)逐漸轉(zhuǎn)變，器官逐漸分化完善。孵化后70 d仔魚的各鰭已基本長成，側(cè)線也已經(jīng)發(fā)育完全，進入幼魚階段。

Farris[20]認為，卵黃囊仔魚分3個階段：出膜后為快速生長期，卵黃囊消失前后為慢速生長期，還未對外攝食時為負生長期。拉薩裂腹魚的初孵仔魚較大，出膜時全長為10.71 cm，卵黃囊也較大，即使在外界食物短缺的情況下，也可為仔魚新陳代謝提供能量，能在嚴峻的環(huán)境下逃避敵害、建立外源攝食，保證仔魚更大的成活率。拉薩裂腹魚卵黃囊仔魚孵化后前7 d為快速生長，到背鰭開始分化時(8 d)，此時卵黃囊并未吸收完全，進入混合營養(yǎng)期，此后仔魚生長減緩，筆者認為，可能是卵黃較大的原因，拉薩裂腹魚未出現(xiàn)負生長。20 d左右仔魚的攝食能力逐漸增強，能較好地攝食外源性營養(yǎng)，其生長速度再次加快。

3.3 拉薩裂腹魚早期發(fā)育與環(huán)境適應(yīng)性

拉薩裂腹魚親魚采自雅魯藏布江支流，地處高原，流域內(nèi)生境貧瘠，水源主要為雪山融水，地表徑流所帶入的營養(yǎng)物質(zhì)少，不適宜浮游生物的生長繁殖，同時，自然繁育季節(jié)水溫低，餌料生物貧乏[18,21]。本研究中溫度試驗表明，雖然升高水溫可以縮短拉薩裂腹魚的胚胎發(fā)育時間，但溫度超過17 ℃后，孵化率大幅降低、畸形率大幅升高，在生產(chǎn)中為了縮短生產(chǎn)時間，可適當提高水溫，但建議不要超過17 ℃。

拉薩裂腹魚卵徑和卵黃較大，所含營養(yǎng)物質(zhì)豐富，有利于應(yīng)對貧乏的食物資源，減輕攝食壓力；卵周隙較大，卵粒在水流中易被托起，隨水漂流，到水流較緩的水域沉入河床卵石縫孵化，有利于隱藏。同時，拉薩裂腹魚的胚胎發(fā)育過程中胸鰭原基和尾部的鰭褶均在出膜前分化形成，心臟、血液循環(huán)的較早出現(xiàn)等，使仔魚在出膜后能更順利地適應(yīng)該區(qū)域貧營養(yǎng)環(huán)境，其早期發(fā)育特征與其生存的環(huán)境具有一定的適應(yīng)性。