劉建男，郭羿，倪萍，郭思聰，馬紅麗,陸曉岑，葉仕根

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，大連市海珍品疾病防控重點實驗室，遼寧 大連 116023)

殺鮭氣單胞菌Aeromonassalmonicida隸屬氣單胞菌科Aeromonadacea氣單胞菌屬Aeromonas，為已知最古老的魚類病原體之一[1-2]。殺鮭氣單胞菌是鮭科Salmonidae魚類重要的病原菌，可引發(fā)鮭科魚類“癤瘡病”[3]。最初學(xué)界認(rèn)為，殺鮭氣單胞菌具有宿主專一性，但深入研究后發(fā)現(xiàn)其宿主并不僅限于此，還可感染鯉Cyprinuscarpio[4]、鱈Gadusmorhua[5]、許氏平鲉Sebastesschlegeli[6]、烏鱧Channaargus[7]、異育銀鯽Carassiusauratusgibelio[8]、大菱鲆Scophthatmusmaximus[9]等多種魚類。1992年Toranzo等[10]首次從西班牙某養(yǎng)殖場患病大菱鲆體內(nèi)分離到殺鮭氣單胞菌，隨后類似病例相繼在丹麥[11]、挪威[12]和中國[13]等地被報道。殺鮭氣單胞菌的感染給大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失。

大菱鲆隸屬于鰈形目Pleuronectoidei菱鲆科Scophthalmidae瘤棘鲆屬Psetta，原產(chǎn)于大西洋東北沿岸，俗稱歐洲比目魚，在中國又稱“多寶魚”，是一種極具經(jīng)濟價值的冷水性魚類[14-16]。2017年，中國大菱鲆年產(chǎn)量高達(dá)45 500 t，年產(chǎn)值已達(dá)29 575萬美元(http://www.fao.org/fishery/statistics)，大菱鲆已成為中國鰈鲆類養(yǎng)殖第一大品種。然而，隨著大菱鲆養(yǎng)殖集約化程度不斷提高、養(yǎng)殖密度日益加大，大菱鲆病害頻發(fā)，各種病毒性疾病、細(xì)菌性疾病和寄生蟲病的報道日漸增多[17-19]。2018年4月，遼寧省大連市某養(yǎng)殖場大菱鲆暴發(fā)了流行性疾病，其皮膚呈串珠狀隆起、變白且隆起部分皮下肌肉出血、化膿、潰爛，兩天內(nèi)累計死亡率高達(dá)10%，作者從患病大菱鲆體內(nèi)分離得到一株病原菌DLPJC01(GenBank登錄號：MK881070)，通過分子生物學(xué)鑒定及人工感染試驗證實，該病原菌為殺鮭氣單胞菌無色亞種。呂俊超等[20]雖于2008年報道了殺鮭氣單胞菌感染大菱鲆的組織病理學(xué)變化，但病魚卻未出現(xiàn)典型癤瘡癥狀，組織內(nèi)也未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌存在。而本研究中病魚體表癤瘡癥狀典型，且各器官組織內(nèi)有大量細(xì)菌定殖，與之前報道有明顯差異。因此，本研究中在分析該分離株致病性的同時研究了患典型“癤瘡病”大菱鲆的病理損傷特征，以期為進(jìn)一步研究殺鮭氣單胞菌的致病機制及臨床防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病大菱鲆共計10尾，體質(zhì)量為(180±10)g，體長為(15±3)cm，取自遼寧省大連市某養(yǎng)殖場海上養(yǎng)殖網(wǎng)箱。

健康大菱鲆共計30尾，體質(zhì)量為(15±3)g，體長為(6±1)cm，購自遼寧省大連市某養(yǎng)殖場，暫養(yǎng)于大連市海珍品疾病防控重點實驗室循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中。

藥敏紙片、細(xì)菌生化微量鑒定管購于杭州微生物試劑有限公司；結(jié)晶紫、伊紅、革蘭氏染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，細(xì)菌DNA提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床檢查與病原菌分離 首先用肉眼觀察患病大菱鲆外觀癥狀，取病魚鰓絲與體表黏液鏡檢。然后解剖病魚，觀察病魚內(nèi)臟器官異常病變。無菌條件下取病魚肝、脾、腎等組織，劃線接種于含2%NaCl的NA平板，28 ℃下培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢菌株分離純化。觀察菌落形態(tài)，挑取單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色。

1.2.2 人工感染試驗 分離菌株在含2%NaCl的NA平板上28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水沖洗平板上菌落，采用麥?zhǔn)媳葷岱╗21]調(diào)節(jié)菌懸液濃度至1×108、1×109cfu/mL。健康大菱鲆于實驗室暫養(yǎng)一周后，按照注射細(xì)菌濃度分組，分為1×108、1×109cfu/mL和對照組3組，每組10 尾魚。試驗組每尾魚腹腔注射0.1 mL菌液，對照組注射0.1 mL生理鹽水。注射后觀察大菱鲆的發(fā)病癥狀及死亡情況，連續(xù)觀察15 d。

1.2.3 生理生化鑒定及藥敏試驗 參照細(xì)菌生化微量鑒定管說明書鑒定分離菌株。采用紙片擴散法，將濃度為1×107cfu/mL菌液均勻涂布于含2%NaCl的NA平板后貼上藥敏紙片，28 ℃下培養(yǎng)24 h并測量抑菌圈直徑。

1.2.4 16S rDNA測序分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取分離菌株的DNA后進(jìn)行16S rDNA基因的PCR擴增。16S rDNA基因擴增引物(27F： 5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′；1492R：5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′)，預(yù)期擴增片段大小約為1500 bp。PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 18.25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA酶 0.25 μL，dNTP 1 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，54 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸90 s，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后并送至北京華大基因有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank中用Blast軟件進(jìn)行比對，選擇相似度較高的序列用MEGA5軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。系統(tǒng)進(jìn)化樹分支置信度用1000次重復(fù)自舉檢驗，在計算過程中，系統(tǒng)自動省略不確定和缺失的位點。

1.2.5 病理切片制作與觀察 取自然發(fā)病大菱鲆的肝、脾、腎、腸道、腦、鰓等組織，用10%甲醛溶液固定48 h，以健康大菱鲆組織為對照。修塊后逐級脫水，透明、浸蠟，常規(guī)石蠟包埋后切片，切片厚度為4 μm。經(jīng)H.E染色，中性樹膠封片后用Leica DM4000 LED拍照系統(tǒng)觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病魚的臨床癥狀與病原菌分離結(jié)果

病魚體色發(fā)黑，體表黏液增多，靠近背鰭部分的背部肌肉呈串珠狀隆起，甚至連成一片，且隆起部位發(fā)白，劃開隆起的肌肉組織發(fā)現(xiàn)大菱鲆皮下肌肉出血、化膿、潰爛(圖1)。取病魚鰓絲和體表黏液鏡檢未發(fā)現(xiàn)寄生蟲。解剖發(fā)現(xiàn)，部分病魚腹腔內(nèi)出現(xiàn)帶血腹水，病魚肝、脾、腎等內(nèi)臟器官充血及出血，脾臟和腎臟腫大，腸道發(fā)炎。

從發(fā)病大菱鲆體內(nèi)分離得到一株優(yōu)勢菌，在28 ℃條件下，該菌株在含2%NaCl的NA培養(yǎng)基上形成白色、中央略隆起、邊緣光滑、直徑為(0.9±0.1)mm的圓形菌落，且革蘭氏染色結(jié)果為陰性。

2.2 人工感染試驗結(jié)果

從表1可見：1×108cfu/mL試驗組大菱鲆死亡率達(dá)30%，1×109cfu/mL試驗組大菱鲆全部死亡，死亡大菱鲆均與自然發(fā)病條件下病魚癥狀相同；對照組無任何異常。

表1 人工感染試驗結(jié)果Tab.1 Challenage experiments results of the isolated strains DLPJC01

2.3 生理生化鑒定與藥物敏感性結(jié)果

從表2可見，生理生化比對發(fā)現(xiàn)，該菌株與殺鮭氣單胞菌無色亞種最為接近。

表2 DLPJC01與殺鮭氣單胞菌無色亞種的理化特性比較Tab.2 Comparisons of physicochemical characteristics of strain DLPJC01 with Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes

從表3可見：該菌株對慶大霉素、頭孢曲松、鏈霉素、頭孢噻肟、新霉素5種抗生素高度敏感；對紅霉素中度敏感；對復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、卡那霉素等13種抗生素完全耐藥。

表3 菌株DLPJC01抗生素藥敏試驗結(jié)果 Tab.3 Antibiotic susceptibility of strain DLPJC01

2.4 16S rDNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析

以分離菌株DLPJC01的DNA為模板，擴增的16S rDNA基因條帶均與預(yù)期相符，測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast比對，結(jié)果顯示，與登錄號為KX238884.1的殺鮭氣單胞菌無色亞種Aeromonassalmonicidasubsp.achromogenes相似度最高，可達(dá)99.9%以上。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果也顯示，DLPJC01菌株與殺鮭氣單胞菌聚為一支(圖2)。

2.5 組織病理變化

顯微鏡下觀察健康和自然發(fā)病大菱鲆各器官的組織切片,可見患病大菱鲆的鰓、肝臟、脾臟、腎臟、腸道和肌肉等處的組織均有極為明顯的病理變化(圖3)。鰓組織以鰓小片明顯水腫、增寬、間隔縮小為主要特征；鰓小片上皮細(xì)胞與毛細(xì)血管成片剝離(→)，大部分上皮細(xì)胞腫脹、變圓、相互離散，嚴(yán)重時完全脫落僅殘留光滑的血管內(nèi)皮細(xì)胞；毛細(xì)血管擴張淤血，內(nèi)有大量藍(lán)紫色細(xì)菌團塊形成栓子(★)，阻塞了毛細(xì)血管使其擴張，呈氣球狀甚至破裂出血(圖3-B)。肝組織的病變相對較輕，主要表現(xiàn)為小靜脈、中央靜脈和肝血竇擴張、淤血，部分區(qū)域紅細(xì)胞溶血；部分小靜脈血漿淤積，可見殘留的紅細(xì)胞碎片和細(xì)胞核，且組織中可見藍(lán)紫色的細(xì)菌團塊(圖3-D)。脾實質(zhì)組織呈多發(fā)性灶性壞死，壞死組織紅染，細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)消失，僅殘留基本的細(xì)胞輪廓(→)，為典型的凝固性壞死，有的區(qū)域甚至溶解液化；組織中有大量藍(lán)紫色的細(xì)菌團塊(★)，細(xì)菌團塊交錯分布于著色深淺不一的壞死組織中，使整個脾臟在鏡下呈花斑狀(圖3-F)。腎間質(zhì)呈多發(fā)性灶性壞死，部分壞死組織溶解、消失導(dǎo)致腎間質(zhì)疏松，腎間質(zhì)中還可見大量的藍(lán)紫色細(xì)菌團塊(★)；多數(shù)腎小管壞死，呈紅染狀，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變圓，出現(xiàn)大量蛋白質(zhì)樣紅染顆粒，嚴(yán)重時腎小管上皮細(xì)胞核碎裂、染色質(zhì)邊移，甚至整個細(xì)胞完全碎裂，腎小管結(jié)構(gòu)完全崩解(→)(圖3-H)。腸道病變以腸上皮細(xì)胞核染色質(zhì)邊移為主要特征，腸絨毛黏液細(xì)胞明顯增多；腸上皮細(xì)胞腫脹、壞死，脫落甚至填滿了腸絨毛間的間隙(圖3-J)。肌纖維輕度水腫、間隙增寬，周圍可見呈條索狀分布的藍(lán)紫色細(xì)菌；嚴(yán)重區(qū)域肌纖維溶解、斷裂，肌漿凝固性壞死，壞死組織中可見淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，同時脂肪細(xì)胞出現(xiàn)炎癥(圖3-L)。

3 討論

3.1 魚類感染殺鮭氣單胞菌的臨床癥狀

殺鮭氣單胞菌是養(yǎng)殖鮭鱒最重要的一種病原菌，病魚通常表現(xiàn)為體側(cè)或尾部形成特征性膿腫，嚴(yán)重時膿腫部位潰爛形成潰瘍[22]。非鮭鱒魚類感染殺鮭氣單胞菌可引起局部感染，嚴(yán)重時引起皮膚潰瘍，稱為“非典型”癤瘡病[23]。呂俊超等[20]報道的感染殺鮭氣單胞菌無色亞種的大菱鲆僅出現(xiàn)了口周圍皮膚皮下出血的癥狀，而本研究中患病大菱鲆的“癤瘡”癥狀主要表現(xiàn)為背部肌肉出現(xiàn)串珠狀隆起甚至連成一片，且隆起的肌肉組織發(fā)白，這種癥狀與之前報道的大菱鲆癤瘡病有明顯差異。

3.2 殺鮭氣單胞菌的致病機理

Farto等[24]研究發(fā)現(xiàn)，感染殺鮭氣單胞菌亞種的鮭12 h后，細(xì)菌即可侵入大菱鲆的鰓、腸道、肝臟和腎臟，并在感染后期侵入肌肉組織，且細(xì)菌在組織中持續(xù)存在并導(dǎo)致大菱鲆死亡。而Bj?rnsdóttir等[25]用殺鮭氣單胞菌無色亞種人工感染大菱鲆后則在大菱鲆鰓組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)藍(lán)紫色細(xì)菌團塊。本研究中在患病大菱鲆的鰓、肝、脾、腎等組織中同樣觀察到大量藍(lán)紫色的細(xì)菌團塊，這種現(xiàn)象與殺鮭氣單胞菌無色亞種無運動性的特點有關(guān)[26]。菌株只能在侵染的部位分裂增殖，繼而形成藍(lán)紫色的細(xì)菌團塊。在鰓組織中的細(xì)菌團塊堵塞了鰓小片毛細(xì)血管，形成栓塞，進(jìn)而導(dǎo)致鰓組織血液循環(huán)障礙、擴張淤血甚至破裂出血，影響大菱鲆的呼吸功能。魚類的腎臟和脾臟是重要的免疫器官，魚類腎臟可有效抵御外界病原的入侵，脾臟則可為魚體提供充足的血液和免疫細(xì)胞[27]。呂俊超等[20]研究僅發(fā)現(xiàn)殺鮭氣單胞菌無色亞種可引起大菱鲆腎小管上皮細(xì)胞水樣變性并與周圍組織分離，脾臟中紅髓和白髓界限不清等病理變化，而本研究中觀察發(fā)現(xiàn)，患病大菱鲆的腎臟、脾臟內(nèi)有大量藍(lán)紫色細(xì)菌團塊，呈多發(fā)性灶性壞死，且部分壞死組織溶解液化，可見免疫器官受損致使細(xì)菌在病魚體內(nèi)迅速擴散，從而造成魚體嚴(yán)重?fù)p傷甚至死亡。

3.3 殺鮭氣單胞菌感染的藥物治療

本研究中從患病大菱鲆體內(nèi)分離純化得到菌株DLPJC01，與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[26]中標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，缺乏利用半乳糖、乙酰氨基葡萄糖作為碳源的能力，而具有V.P反應(yīng)和利用纖維二糖、D-甘露醇的能力。在Pedersen等[28]的研究中也同樣發(fā)現(xiàn)了一些生理生化指標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)菌株不同的“非典型”殺鮭氣單胞菌，說明這種“非典型”殺鮭氣單胞菌的情況普遍存在。這可能是分離株生存環(huán)境、宿主的自身特性引起的，也可能與該菌的致病力有關(guān)。藥敏試驗結(jié)果顯示，該菌株對復(fù)方新諾明在內(nèi)的13種抗菌藥物完全不敏感，這表明養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)了濫用抗菌藥物的現(xiàn)象。2016年“多寶魚藥物殘留事件”給大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)蒙上了一層陰影，因此，養(yǎng)殖生產(chǎn)中不能盲目用藥、濫用藥，而應(yīng)該在藥敏試驗結(jié)果的指導(dǎo)下進(jìn)行針對性治療。