熊穎 郭芳 熊宇 張萬里 胡艷艷

胃癌(gastric carcinoma)是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤，主要起源于胃黏膜上皮[1]。胃癌的發(fā)病具有區(qū)域和性別的差異性，可能與飲食結(jié)構(gòu)及生活習慣、幽門螺旋桿菌感染等因素有關，但其發(fā)病的確切機制尚不明確[2]。因此，探索胃癌的發(fā)病機制及胃癌細胞凋亡的相關信號通路對臨床早期診斷及治療具有重要的價值。FoxO3蛋白是細胞內(nèi)重要的自噬調(diào)控因子，其活性主要受到沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)的去乙?；{(diào)節(jié)。Sirt1/FoxO3信號通路與多種病理過程密切相關，如氧化應激、炎性反應、肥胖和腫瘤等[3,4]。但目前尚未見到Sirt1/FoxO3信號通路與胃癌細胞凋亡過程的相關報道?？鄥A是為豆科植物苦參的干燥根、植株、果實經(jīng)乙醇等有機溶劑提取制成的生物堿，具有抗炎、殺菌、護肝和利尿的藥理活性[5-7]。本文對苦參堿促進胃癌細胞SGC7901細胞凋亡的AKT/FoxO3信號通路機制進行研究，為臨床新藥研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞及分組 SGC7901細胞由本實驗室保存。將生長狀態(tài)良好(37℃，5%CO2)的胃癌SGC7901細胞隨機分為對照組、Nicotinamide組(20 μmol/L)、苦參堿低劑量組(10 μmol/L)、苦參堿高劑量組(40 μmol/L)。Nicotinamide組細胞給予20 μmol/L的Nicotinamide 4 h，苦參堿低劑量處理組和高劑量組細胞分別給予10 μmol/L和40 μmol/L的苦參堿處理4 h。計算各組細胞的抑制率。抑制率=(對照組OD值-試驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.2 試劑與儀器 兔抗Caspase-3一抗購自Abcam公司(ab13847)；兔抗Bax(MAB846)及兔抗Caspase-9購自R&D公司(MAB8301)；兔抗Bcl-2(sc7382)一抗購自Santa Curz公司；鼠抗Sirt1一抗購自Invitrogen公司(PA5-17232)；鼠抗FoxO3一抗購自Abcam公司(ab58518)；二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；DAPI及Sirt1抑制劑Nicotinamide購自Sigma Aldrich公司?？鄥A購自中國食品藥品檢定研究院(Matrine，批號805-200005，純度HPLC≥98%，本文中采用羧甲基纖維素鈉配制成10-3μmol/L濃度工作液后過濾除菌)。細胞培養(yǎng)箱購自德國美墨爾特公司；細胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)基購自Gibco公司；冷凍離心機購自賽多利斯公司；超凈工作臺購自ESCO公司；移液器購自德國Eppendorf公司；電泳槽及轉(zhuǎn)膜儀購自北京六一儀器廠；熒光顯微鏡購自徠卡公司。

1.3 免疫組織化學法檢測蛋白表達 將用乙醇清潔并滅菌后的載玻片放入培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中進行爬片并進行相應的藥物處理。待各組胃癌細胞爬片并在蓋玻片上生長良好后，無菌PBS輕輕沖洗3次后用冰丙酮(-20℃放置2 h)固定15 min，于生物安全柜的臺面上室溫晾干。用1% Triton-100處理各組細胞爬片1 h增加細胞的通透性，無菌PBS輕搖漂洗3次；4.0%的胎牛血清白蛋白溶液封閉，加一抗(1∶200)4℃孵育6 h，無菌磷酸鹽緩沖液漂洗3次。將載玻片與異硫氰酸熒光素(FITC)標記二抗避光37℃溫孵1 h(1∶300)，PBS漂洗5次后熒光顯微鏡拍照。

1.4 Western Blotting法檢測蛋白表達 SGC7901胃癌細胞培養(yǎng)并進行相應的化合物孵育后用無菌磷酸鹽緩沖液充分沖洗3次，細胞裂解液裂解細胞后提取總蛋白。將總蛋白行10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳和半干法進行轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)膜后的醋酸纖維素膜用4.0%的脫脂牛奶封閉2 h。封閉后將纖維素膜與一抗(1∶200)4℃冰箱中雜交過夜，無菌磷酸鹽緩緩沖液漂洗3次后與辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗20℃反應后進行顯色。用凝膠成像分析系統(tǒng)測定光密度，以GAPDH為內(nèi)參進行蛋白的相對定量分析。

1.5 DAPI染色法檢測細胞凋亡 4組細胞經(jīng)相應處理并爬片培養(yǎng)后進行DAPI染色法：將制好的蓋玻片上滴加20 μl的DAPI(100 ng/ml)染液，染色10 min，用滅菌的純化水沖去DAPI染液，濾紙吸除多余水分，加一滴熒光封片液，置于熒光顯微鏡下(激發(fā)波長380 nm)觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 DAPI染色分析4組細胞凋亡情況 苦參堿組細胞存在凋亡小體(箭頭指向)，且隨著苦參堿劑量的增加，凋亡程度明顯增加；同時，苦參堿對細胞增殖的抑制作用具有劑量依從性效果(P<0.05)。見表1,圖1、2。

表1 苦參堿對細胞增殖的抑制率分析

對照組苦參堿低劑量組苦參堿高劑量組Nicotinamide組

圖2 苦參堿對細胞增殖的抑制率分析

2.2 Western Blotting法分析細胞凋亡蛋白Caspase-3/9表達 與對照組比較，苦參堿組細胞凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達明顯增強，且隨著劑量的增加，上述蛋白表達明顯增大(P<0.05)。見表2，圖3。

表2 Western Blotting法分析細胞凋亡蛋白Caspase-3/9表達分析

圖3 Western Blotting法分析細胞凋亡蛋白Caspase-3/9表達

2.3 Western Blotting法分析細胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2的表達 與對照組比較，苦參堿處理組細胞凋亡蛋白Bax的表達明顯增強而Bcl-2的表達明顯減弱，且隨著劑量的增加，上述蛋白的表達變化越明顯(P<0.05)。見表3，圖4。

表3 Western Blotting法分析細胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2的表達

2.4 Western Blotting法分析Sirt1/FoxO3的表達 與對照組比較，苦參堿處理組FoxO3的表達明顯增強而Sirt1的表達明顯減弱，且隨著劑量的增加，上述蛋白的表達變化越明顯(P<0.05)。見表4，圖5。

圖4 Western Blotting法分析細胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2的表達

表4 Western Blotting法分析Sirt1/FoxO3的表達

圖5 Western Blotting法分析Sirt1/FoxO3的表達

2.5 免疫組織化學法分析Sirt1/FoxO3蛋白的表達 與對照組相比，苦參堿處理組FoxO3蛋白的熒光信號明顯增強而Sirt1蛋白的熒光信號明顯減弱，且隨著劑量的增加，上述蛋白的表達變化越明顯(P<0.05)。見表5，圖6、7。

表5 免疫組織化學法分析Sirt1/FoxO3蛋白的表達分析

3 討論

胃癌是臨床上最常見的消化道惡性腫瘤，且其發(fā)病率和病死率有逐年升高的趨勢。胃癌的早期患者通常進行手術治療，但臨床上確診的患者通常為中晚期患者，目前尚無特效的治療手段?？鄥A主要成分有苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿等多種生物堿，具有抗氧化和抗腫瘤的效果[8,9]。本文在對苦參堿促進胃癌細胞SGC7901細胞凋亡的AKT/FoxO3信號通路機制進行研究時發(fā)現(xiàn)與對照組相比，苦參堿細胞Bax、Caspase-3/9和FoxO3的表達明顯增強而Bcl-2、Sirt1蛋白的表達明顯減弱，DAPI染色凋亡小體明顯增多；免疫細胞化學發(fā)現(xiàn)FoxO3的熒光強度增強而Sirt1蛋白的熒光強度減弱，且苦參堿的效果有劑量依從性，表明苦參堿可能通過調(diào)控Sirt1/FoxO3信號通路促進胃癌細胞SGC7901的細胞凋亡過程。

對照組苦參堿低劑量組苦參堿高劑量組Nicotinamide組

Sirt1蛋白表達

對照組苦參堿低劑量組苦參堿高劑量組Nicotinamide組

FoxO3蛋白的表達

圖6 免疫組織化學法分析Sirt1及FoxO3蛋白的表達(免疫組化×400)

圖7 免疫組織化學法分析Sirt1/FoxO3蛋白的表達分析；與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

Sirt1/FoxO3信號通路調(diào)控了細胞的多種病理及生理過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及細胞凋亡過程密切相關，且可能是藥物治療的潛在靶點[4,10]。以往的研究發(fā)現(xiàn)羥胺三唑能夠通過抑制NKκB和激活SIRT1蛋白改善荷瘤小鼠的肌萎縮癥狀，表明SIRT1蛋白參與了此病理過程[11]。Hagenbuchner等[12]研究也發(fā)現(xiàn)在成神經(jīng)細胞瘤中細胞核FoxO3能夠促進腫瘤細胞的血管發(fā)生過程，提示FoxO3蛋白可能具有促進腫瘤發(fā)生的作用，與本研究的結(jié)論一致。在分析SIRT1作用的靶點時也發(fā)現(xiàn)SIRT1能夠通過作用于SREBP1蛋白和脂肪形成過程發(fā)揮其促進子宮內(nèi)膜腫瘤增殖的作用[13]。與以往的研究結(jié)論[14-16]一致，本文也發(fā)現(xiàn)與對照組比較，苦參堿細胞Bax、Caspase-3/9和FoxO3的表達明顯增強而Bcl-2、Sirt1蛋白的表達明顯減弱，DAPI染色凋亡小體明顯增多；免疫細胞化學發(fā)現(xiàn)FoxO3的熒光強度增強而Sirt1蛋白的熒光強度減弱，且苦參堿的效果有劑量依從性，表明苦參堿可能通過調(diào)控Sirt1/FoxO3信號通路促進胃癌細胞SGC7901的細胞凋亡過程。FoxO3蛋白作為腫瘤的抑制因子，可以通過調(diào)節(jié)核糖核苷酸還原酶亞基的表達來改善腫瘤患者的生存狀態(tài)和預后，且FoxO3蛋白表達越高患者預后越好[17]。同時，miR-34a/SIRT1/p53反饋循環(huán)也與腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移過程相關，且長非編碼RNA分子HNF1A-AS1可以通過調(diào)控miR-34a/SIRT1/p53軸影響結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移過程[18]。而本研究發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2/Caspase-3/9等細胞凋亡蛋白參與了胃癌細胞的凋亡過程，而Sirt1/FoxO3信號轉(zhuǎn)導通路抑制劑Nicotinamide組的上述凋亡蛋白的異常表達得到顯著的恢復，而與Nicotinamide組細胞一致，苦參堿組細胞的上述蛋白的異常表達也得到明顯的改善，表明苦參堿可能是通過調(diào)控Sirt1/FoxO3信號通路影響細胞凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2/Caspase-3/9的表達而促進胃癌細胞的凋亡過程。在以后的研究中課題組將進一步分析此過程中是否有p53蛋白的參與，且通過RNAi進一步闡述Sirt1/FoxO3信號轉(zhuǎn)導通路在苦參堿促進胃癌細胞凋亡過程中的參與作用。以往的研究發(fā)現(xiàn)Sirt1/FoxO3蛋白也是藥物干預腫瘤的潛在靶點[19,20]。Yan等[21]研究也證實miR-629可以作用于FoxO3蛋白調(diào)控胰腺癌的進展過程，與本研究發(fā)現(xiàn)的苦參堿可以通過調(diào)控Sirt1/FoxO3信號通路促進胃癌細胞的凋亡結(jié)論一致。

因此，苦參堿可能通過調(diào)控Sirt1/FoxO3信號通路促進胃癌細胞SGC7901的細胞凋亡過程。