彭江，翟齊嘯，于雷雷，田豐偉，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少和骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，導(dǎo)致骨的脆性增加以致易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病[1]。其嚴(yán)重后果是導(dǎo)致骨折，嚴(yán)重危害中老年人尤其是絕經(jīng)后婦女的健康[2]。目前治療骨質(zhì)疏松的藥物一類是抑制骨吸收，另一類是促進(jìn)骨形成。這些藥物均有各自的代謝特點(diǎn)及適用人群，有的藥物還伴隨一些特殊的不良反應(yīng)[3]。因此尋找安全有效的具有改善骨質(zhì)疏松癥的物質(zhì)已經(jīng)成為重要的研究方向。研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松與腸道健康密切相關(guān)[4]，腸道微生物可通過調(diào)節(jié)腸道菌群、腸道免疫因子、腸道屏障等進(jìn)一步影響骨骼免疫狀態(tài)、改變血清素，皮質(zhì)醇和性激素的代謝，從而打破骨形成和吸收之間的平衡[5-6]。無菌小鼠與臨床實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群對骨代謝具有重要影響[7]，利用抗生素、微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)腸道菌群后也進(jìn)一步影響了骨量水平。

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，特定益生菌株如鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillusrhamnosus，LGG)、副干酪乳桿菌、長雙歧桿菌等可減少腸道和骨骼的炎癥，改善腸道通透性并防止骨質(zhì)流失[8-10]。同時(shí)，混合益生菌制劑如VSL#3等可緩解腸道和骨骼的炎癥，促進(jìn)緊密連接蛋白的表達(dá)，降低腸上皮通透性，抑制骨質(zhì)流失[11]。另外，臨床實(shí)驗(yàn)表明羅伊氏乳桿菌可以減輕老年女性骨質(zhì)疏松[12]。膳食補(bǔ)充益生菌可能對骨骼健康有益，具體機(jī)制包括：(1)通過調(diào)節(jié)RANKL，CD4T細(xì)胞和促炎性細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的功能和分化，以及通過修飾Wnt10b，IGF-1和OPG的表達(dá)來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞[13]；(2)通過調(diào)節(jié)腸道菌群和增加有益菌(如雙歧桿菌和乳桿菌)來預(yù)防局部腸道炎癥和通透性，改善骨骼健康[13]；(3)增加代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸的水平，部分增強(qiáng)腸道和骨骼中鈣的吸收和信號(hào)傳導(dǎo)[14]。

本課題組前期從發(fā)酵蔬菜中分離得到1株益生菌(植物乳桿菌CCFM8610)，已證明其具有良好的鎘吸附、抗氧化以及耐酸耐膽鹽特性；同時(shí)能緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫應(yīng)答、抑制細(xì)胞凋亡并保護(hù)細(xì)胞活性。該菌株還具有保護(hù)宿主腸道屏障、減少腸道通透性、緩解腸道氧化損傷、調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)、促進(jìn)宿主細(xì)胞代謝等功效[15-17]。這些對腸道健康的調(diào)節(jié)特性都表明該菌株具備緩解骨質(zhì)疏松的功能潛力。本研究通過雙側(cè)卵巢摘除大鼠建立骨質(zhì)疏松模型，探討了植物乳桿菌CCFM8610對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的改善作用，為益生菌防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS培養(yǎng)基，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase 5, TRACP5)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、大鼠I型膠原交聯(lián)羧基端肽(cross linkedC-telopeptide of type I collagen, CTX-I)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、大鼠胰島素生長因子(insulin-like growth factor-1，IGF-1)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、大鼠內(nèi)毒素(endothelin, ET)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白細(xì)胞介素6(inter leukin-6,IL-6)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒ELISA Kit,南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2 灌胃菌株的制備菌株

乳桿菌菌株保存于添加30%(體積分?jǐn)?shù))甘油的MRS培養(yǎng)基中，保存溫度為-80 ℃，菌株在實(shí)驗(yàn)使用前，連續(xù)活化3次，將菌液8 000×g離心10 min，去上清液，用滅菌生理鹽水將菌泥洗滌3次，重懸菌泥于質(zhì)量濃度為120 g/L的脫脂乳粉溶液中，-80 ℃冰箱保存。使用前將菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至109CFU/mL備用。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究采用的是購自上海斯萊克公司的SPF級健康SD雌性大鼠15只，12周齡，體重為(250±20)g。飼養(yǎng)溫度為(23±2)℃，相對濕度為(50±10)%，小鼠自由飲食，采用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)具體開展時(shí)間：2018-04-10—2018-06-10。將雌性SD未交配大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，每組5只。去卵巢組大鼠以3.3 mL/kg體量的10%(體積分?jǐn)?shù))水合氯醛腹腔注射麻醉后，腹部常規(guī)消毒，腹部正中切口打開腹腔，切除雙側(cè)卵巢后，分2層縫合切口；假手術(shù)組只進(jìn)行腹部切口，切除卵巢周圍部分脂肪組織，不摘除卵巢，其余操作同上。術(shù)后連續(xù)3 d按2×104U/100 g體量注射青霉素抗感染。

術(shù)后3周將存活者按體重隨機(jī)分組，15只雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組：空白組、模型組、菌干預(yù)組，菌干預(yù)組灌胃對應(yīng)的菌懸液(1×109CFU/mL)灌胃體積均為1.5 mL/d，空白組和模型組灌胃等量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃3周。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水，攝食標(biāo)準(zhǔn)飼料，每周稱量1次大鼠體重。

1.4 大鼠骨相關(guān)性指標(biāo)的測定

1.4.1 大鼠股骨結(jié)構(gòu)性指標(biāo)的測定

統(tǒng)一將各組大鼠左側(cè)股骨從長徑中點(diǎn)鋸斷，將股骨遠(yuǎn)心端按要求置于micro CT上，測定其距髁間窩約4 mm附近干骺端的骨密度(bone mineral density, BMD, g/cm3)、骨礦含量(bone mineral content, BMC, g)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction, BV/TV, %)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th, mm)以及骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp, mm)。

1.4.2 大鼠血清骨代謝指標(biāo)的測定

將收集到的大鼠血液放置2 h，3 000×g離心15 min后獲得血清，參照相應(yīng)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中IGF-1、TRACP5、CTX-I。大鼠血清中Ca、P、Mg、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的含量均利用全自動(dòng)血清生化分析儀進(jìn)行測定。

1.4.3 股骨組織病理學(xué)觀察

取大鼠股骨左側(cè)同一位置的組織，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的多聚甲醛溶液固定后，經(jīng)過脫鈣、石蠟包埋、切片、蘇木精和伊紅染色后，在切片掃描儀下切片觀察。

1.5 大鼠腸道中緊密蛋白基因表達(dá)量和內(nèi)毒素的測定

參照過往文獻(xiàn)報(bào)道的方法[18]，提取大鼠結(jié)腸部位總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，最后對腸道中緊密連接蛋白ZO-1、ZO-2、Occludin、Claudin-1的mRNA表達(dá)水平將進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)分析。血清中ET的含量測定采用酶聯(lián)免疫分析法，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 大鼠血清炎癥因子指標(biāo)的測定

血清中炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)水平均采用ELISA試劑盒檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6和SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，采用T檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較(independent-samples T-test)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析檢測多組數(shù)據(jù)(One-Way, ANOVA)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌CCFM8610對大鼠常規(guī)生理指標(biāo)的影響

大鼠在麻醉后1 h時(shí)左右開始逐漸蘇醒，手術(shù)當(dāng)天精神稍差，活動(dòng)量少，飲水?dāng)z食均較少，術(shù)后第1天逐漸恢復(fù)，術(shù)后第3天正常飲水進(jìn)食，手術(shù)傷口恢復(fù)較好，術(shù)后24 h后切口無紅腫。傷口裂縫，可正?；顒?dòng)。術(shù)后72 h后切口無明顯感染征象，手術(shù)1周后切口完全愈合，縫線脫落。手術(shù)后體重顯著增加，連續(xù)3周給大鼠灌胃植物乳桿菌CCFM8610，干預(yù)組大鼠的體重增加幅度趨于正常，與對照組差異不顯著。

2.2 植物乳桿菌CCFM8610對大鼠骨結(jié)構(gòu)和代謝指標(biāo)的影響

由表1可知，手術(shù)后，經(jīng)3周恢復(fù)、3周灌胃干預(yù)，再次行同一部位骨密度檢測。結(jié)果顯示，模型組大鼠股骨骨密度、骨礦含量、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度和骨小梁分離度與空白對照組比較，明顯降低，表明骨質(zhì)疏松模型形成。而植物乳桿菌CCFM8610干預(yù)后，大鼠骨結(jié)構(gòu)性指標(biāo)均有顯著性升高(P<0.05)。由圖1-a～圖1-c可知，與空白組比較，模型組的血清IGF-1顯著降低，血清CTX-I顯著性升高。與模型組比較，干預(yù)組的血清TRACP和CTX-I水平明顯降低，而CTX-I水平顯著升高。由圖1-d、圖1-e可知，與空白組相比，單純造模組大鼠S-Ca、S-P、S-Mg濃度都顯著性下降(P<0.05)；骨形成的指標(biāo)ALP顯著增加(P<0.01)，植物乳桿菌CCFM8610干預(yù)后，ALP顯著下降(P<0.05)，而S-P、S-Mg濃度均得到顯著恢復(fù)。如圖1-f觀察大鼠股骨切片HE染色圖顯示，空白組大鼠股骨骨小梁厚度均勻，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞數(shù)量豐滿。而模型組老鼠切除卵巢1個(gè)月后股骨骨小梁明顯稀疏，孔隙率增加，局部有較大的空隙形成，骨細(xì)胞減少，骨小梁之間間隔明顯寬大，部分骨小梁有斷裂，提示模型組大鼠松質(zhì)骨不僅存在骨量的丟失，還存在結(jié)構(gòu)的破壞，符合骨質(zhì)疏松癥組織形態(tài)學(xué)的表現(xiàn)。而植物乳桿菌CCFM8610干預(yù)后，干預(yù)組骨組織形態(tài)較模型對照組改善，但與空白組比，仍稀疏，骨小梁面積減少，存在斷裂骨小梁。

表1 植物乳桿菌CCFM8610對骨質(zhì)疏松大鼠股骨結(jié)構(gòu)指標(biāo)的影響Table 1 Effects of L.plantarum CCFM8610 on the femoral structure indexes in ovariectomized rats

2.3 植物乳桿菌CCFM8610對大鼠腸道屏障的影響

由表2可知，去卵巢手術(shù)顯著下調(diào)了結(jié)腸的細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白基因相對表達(dá)量，導(dǎo)致了大鼠腸道物理屏障破壞，隨著腸壁通透性增加，腸腔內(nèi)有害菌和抗原入侵結(jié)腸組織，加劇結(jié)腸損傷和炎癥反應(yīng)。而相較于模型對照組，植物乳桿菌CCFM8610組ZO-1、ZO-2、Claudin-1和Occludin相對表達(dá)量均發(fā)生了上調(diào)，其中對Occludin和ZO-1相對表達(dá)量的上調(diào)程度相較于模型對照組高達(dá)2倍，如圖2所示，去卵巢后，內(nèi)毒素顯著上升(P<0.05)，而植物乳桿菌CCFM8610的攝入，顯著降低了內(nèi)毒素含量。具體來看，模型組的ET是(45.23±4.05) EU/mL，干預(yù)組的ET是(36.03±4.22) EU/mL，2組存在顯著差異(P<0.01)。

圖2 植物乳桿菌CCFM8610對骨質(zhì)疏松大鼠血清內(nèi)毒素變化的影響Fig.2 Effects of L.plantarum CCFM8610 on serum ET levels in osteoporotic rats

2.4 植物乳桿菌CCFM8610對大鼠血清炎癥因子指標(biāo)的影響

IL-6和TNF-α兩個(gè)指標(biāo)屬于炎癥促進(jìn)因子，由表3可知，模型組大鼠血清中IL-6和TNF-α含量顯著高于假手術(shù)組。經(jīng)3周連續(xù)植物乳桿菌CCFM8610灌胃，兩者血清含量得到明顯降低。

表3 植物乳桿菌CCFM8610對骨質(zhì)疏松大鼠血清中IL-6和TNF-α濃度的影響Table 3 Effects of L.plantarum CCFM8610 on IL-6 and TNF-α concentrations in serum of ovariectomized rats

3 討論

去卵巢大鼠現(xiàn)已成為研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的經(jīng)典動(dòng)物模型[19]。骨重建過程是成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成作用和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收作用相偶聯(lián)的動(dòng)態(tài)平衡過程[20]。骨的形成是通過成骨細(xì)胞的功能活動(dòng)來實(shí)現(xiàn)的，在成骨細(xì)胞生長、分化和成熟的每個(gè)階段都能分泌不同的蛋白或細(xì)胞因子，作為其特征性標(biāo)志物。TRACP是反映骨質(zhì)破壞狀態(tài)的常用指標(biāo)[21]。CTX-I是反映骨吸收的特異性指標(biāo)之一，在破骨細(xì)胞功能活躍，骨吸收速率異常增快的情況下，才會(huì)有大量的I型膠原溶解和I型膠原交聯(lián)羧基末端肽排泄入血，并最終經(jīng)腎臟排出[22-23]。本實(shí)驗(yàn)通過雙側(cè)卵巢切除術(shù)建立骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，從骨密度、骨代謝和血清細(xì)胞因子等方面探討了植物乳桿菌CCFM8610對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的改善作用并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌CCFM8610能夠顯著調(diào)節(jié)去卵巢大鼠骨代謝水平，增加骨密度并增強(qiáng)其骨吸收，緩解骨破壞性能，能顯著改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥。

我們將CCFM8610對去卵巢骨質(zhì)疏松的緩解歸因于以下兩方面。一方面，RAEHTZ等[24-25]提出，雌激素缺乏會(huì)增加腸道通透性，從而降低屏障完整性。具體而言，雌激素缺乏導(dǎo)致緊密連接蛋白數(shù)量的轉(zhuǎn)錄水平降低，例如Claudin-2,-3和-15，以及JAM3，它們都被證明可以調(diào)節(jié)腸屏障的完整性[26-27]。此外，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，雌激素缺乏的小鼠血清內(nèi)毒素水平升高，腸屏障滲透能力受損。這些研究表明，由雌激素缺乏引起的腸道通透性增加導(dǎo)致進(jìn)入上皮黏膜下層的抗原負(fù)荷增加，從而影響免疫細(xì)胞的活化和破骨細(xì)胞生成細(xì)胞因子的局部產(chǎn)生[28]。本研究表明去卵巢手術(shù)會(huì)導(dǎo)致腸屏障受損，致病菌產(chǎn)生過量內(nèi)毒素，導(dǎo)致腸道生態(tài)失調(diào)。而植物乳桿菌CCFM8610可通過改善腸道緊密連接蛋白表達(dá)的降低、修復(fù)腸上皮屏障受損，同時(shí)降低去卵巢引起的內(nèi)毒素增加，進(jìn)而阻止腸道內(nèi)毒素泄露，改變宿主腸道菌群組成、恢復(fù)其多樣性和穩(wěn)態(tài)來抑制骨吸收。過往研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可通過各種生理調(diào)節(jié)機(jī)制提高宿主腸道的屏障功能。具體機(jī)制是：(1)從物理屏障的角度，益生菌可通過保護(hù)緊密連接蛋白ZO-1及Occludin，避免細(xì)胞骨架F-actin的重排，提高腸黏膜的完整性，并促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的代謝活性[29]；(2)從化學(xué)屏障的角度，益生菌可促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞分泌包括MUC2、MUC3在內(nèi)的黏蛋白，從而抑制致病或有害微生物對腸黏膜的黏附[30]；(3)從免疫屏障的角度，益生菌可提高外周血白細(xì)胞及腹膜巨噬細(xì)胞的吞噬活性并調(diào)節(jié)IFN-γ表達(dá)，促進(jìn)腸道的特異及非特異性免疫[31]；(4)從微生物屏障的角度，益生菌可通過產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素等調(diào)控宿主腸道微生態(tài)的結(jié)構(gòu)與組成[32]；從而保護(hù)腸道屏障。

另一方面，炎癥因子在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[33]。TNF-α作為腫瘤壞死因子家族的一員，是重要的破骨細(xì)胞激活因子，其可直接刺激破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖分化[34]，也可通過抑制破骨細(xì)胞凋亡延長破骨細(xì)胞的存活時(shí)間[35]。IL-6是反映骨丟失的重要信號(hào)，由成骨細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞合成并分泌，可直接促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖分化，刺激骨吸收[36]。IL-6和IL-6受體在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過程中有重要作用[37]，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者體內(nèi)IL-6的mRNA水平明顯高于正常絕經(jīng)婦女[38]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物乳桿菌CCFM8610顯著降低了骨質(zhì)疏松癥大鼠血清炎癥因子活性，提示其能通過降低TNF-α等炎癥因子的水平抑制破骨細(xì)胞活性。大量研究發(fā)現(xiàn)，益生菌的免疫調(diào)節(jié)活性成分主要是細(xì)胞壁、胞外多糖、代謝物；其調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫主要是通過抑制核因子-κB以及絲裂原活化蛋白激酶代謝通路；益生菌刺激腸道分泌黏液、增強(qiáng)黏膜的穩(wěn)定性以及調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞的吞噬能力與分泌細(xì)胞因子的能力，提高宿主的非特異性免疫能力[39]。此外，益生菌還能通過Toll樣受體信號(hào)通路刺激巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子，介導(dǎo)輔助型T細(xì)胞0(T helper cell 0，Th0)分化成Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞，同時(shí)刺激宿主體內(nèi)B淋巴細(xì)胞的增殖分化，產(chǎn)生IgA、IgG等免疫球蛋白，調(diào)節(jié)宿主的特異性免疫能力[40]。

綜上，本研究表明植物乳桿菌CCFM8610可通過調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)及腸道屏障緩解去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松癥，為開發(fā)預(yù)防骨質(zhì)疏松的有效膳食干預(yù)方案提供了新的思路。