錢(qián)恒彥,潘寶貴,刁衛(wèi)平,戈 偉,郭廣君,劉金兵,陳學(xué)好,王述彬*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014)

辣椒(Capsicumspp.)起源于中南美洲熱帶地區(qū),包含5個(gè)栽培種和22個(gè)野生種,其中5個(gè)栽培種分別為一年生辣椒(C.annuum)、中國(guó)辣椒(C.chinense)、漿果狀辣椒(C.baccatum)、灌木狀辣椒(C.frutescens)和絨毛辣椒(C.pubescens)[1]。辣椒為我國(guó)第一大蔬菜作物,冷害是我國(guó)保護(hù)地辣椒生產(chǎn)中主要的逆境因子[2]。選用耐冷辣椒品種為抵御冷害的有效措施之一,鑒定評(píng)價(jià)耐冷材料則為辣椒耐冷育種的首要任務(wù)[3]。

C.annuum通常具有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀,是我國(guó)辣椒生產(chǎn)的主要栽培種類型[4]。在前人研究中,施加冷害脅迫條件,通過(guò)種子發(fā)芽指標(biāo)(如發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù))、冷害指數(shù)、抗氧化酶(如SOD、POD、APX)活性、脯氨酸(Pro)含量、丙二醛(MDA)含量等指標(biāo),對(duì)C.annuum材料進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià),并篩選出一批耐冷材料[5-9]。

研究結(jié)果表明,許多抗病、抗逆基因存在于C.chinense、C.baccatum、C.frutescens和C.pubescens這4個(gè)栽培種中；研究者通常采用種間雜交方法,將這4個(gè)栽培種的優(yōu)異基因?qū)隒.annuum,如抗炭疽病基因[10]、抗CMV基因[11]等,但與這4個(gè)栽培種耐冷性相關(guān)的研究與利用仍較少。

我們以分屬于5個(gè)栽培種的14份辣椒自交系為試驗(yàn)材料,采用模糊隸屬函數(shù)分析方法,對(duì)辣椒苗期的耐冷性進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià),以期篩選出耐冷性較強(qiáng)的辣椒材料,為深入研究辣椒的耐冷機(jī)理和材料創(chuàng)制提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究供試材料共有14份(見(jiàn)表1),其中A136、A270和P70為一年生辣椒(C.annuum), PI632927、PI596055和PI281320為漿果狀辣椒(C.baccatum), PI241650和Grif9238為中國(guó)辣椒(C.chinense), PI439512、PI439521和PI585251為灌木狀辣椒(C.frutescens), PI585270、PI593617和PI593632為絨毛辣椒(C.pubescens)。

表1 供試的14份辣椒材料的來(lái)源

1.2 冷脅迫處理

試驗(yàn)在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。于2018年10月23日播種,50孔穴盤(pán)育苗,待幼苗長(zhǎng)至4葉1心時(shí),采用直徑15 cm、高12 cm的塑料花盆移栽,移入人工氣候室進(jìn)入適應(yīng)性生長(zhǎng),溫度為25 ℃/20 ℃(晝/夜)，光周期為12 h/12 h，光照強(qiáng)度為4000 lx，相對(duì)濕度為65%～70%。在適應(yīng)生長(zhǎng)7 d后,采用4 ℃±1 ℃進(jìn)行冷脅迫處理,光周期、光照強(qiáng)度和相對(duì)濕度與適應(yīng)生長(zhǎng)期相同。

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定

分別在冷脅迫處理0、6、12、24、48 h時(shí),采集同一部位去除葉脈的真葉,放入液氮速凍,于-80 ℃冰箱保存。每個(gè)重復(fù)采樣3株,混合取樣,于冰上操作,每個(gè)重復(fù)稱重0.1 g,3次生物學(xué)重復(fù)。采用北京索萊寶科技有限公司的試劑盒測(cè)定SOD活性(貨號(hào)BC0170)、POD活性(貨號(hào)BC0090)、MDA含量(貨號(hào)BC0020)、氧自由基(OFR)產(chǎn)生速率(貨號(hào)BC1290)、過(guò)氧化氫(H2O2)含量(貨號(hào)BC3590),采用南京建成生物工程研究所的試劑盒檢測(cè)Pro含量(貨號(hào)A107-1-1)。計(jì)算變異系數(shù)，其計(jì)算公式為：變異系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)分析法計(jì)算隸屬函數(shù)值[12]及平均隸屬度[13]。對(duì)SOD、POD、Pro采用以下公式計(jì)算隸屬函數(shù)值：隸屬函數(shù)值=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)。對(duì)MDA、H2O2采用以下公式計(jì)算隸屬函數(shù)值：隸屬函數(shù)值=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)。式中:Xij表示i材料j指標(biāo)的測(cè)定值；Xjmin和Xjmax分別表示所有材料j指標(biāo)的最小值和最大值；j表示某項(xiàng)指標(biāo)。

采用Microsoft Office Excel 2010整理數(shù)據(jù),應(yīng)用DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、作圖和相關(guān)性分析,采用Tukey法進(jìn)行多重比較分析,采用聚類分析法、隸屬函數(shù)法進(jìn)行耐冷性分級(jí)評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷脅迫對(duì)辣椒耐冷性的影響

當(dāng)植物受到冷脅迫時(shí),其抗氧化酶會(huì)清除植物體內(nèi)的氧自由基,Pro含量會(huì)升高,有助于細(xì)胞組織保持含水量,防止植株脫水死亡。隨著冷脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),植物體內(nèi)H2O2含量及OFR產(chǎn)生速率都會(huì)增加,抗氧化酶無(wú)法及時(shí)清除,最終導(dǎo)致膜質(zhì)過(guò)氧化。本研究結(jié)果(表2)表明,在冷脅迫處理48 h內(nèi),SOD活性總體呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì),在6 h時(shí)達(dá)到峰值,且與0 h相比差異顯著(P<0.05)。POD活性在冷脅迫處理48 h內(nèi)均值都高于0 h,且在12 h時(shí)達(dá)到最高,為1709.37 U/g。Pro含量在冷脅迫處理0～24 h期間下降,在24～48 h期間升高,且在冷脅迫48 h時(shí)較0 h上升0.07 μg/g。H2O2含量在冷脅迫0～12 h期間下降,在12～48 h期間升高。OFR產(chǎn)生速率在冷脅迫處理期間始終高于0 h時(shí)的。MDA含量在冷脅迫處理6 h時(shí)達(dá)到最大值61.98 nmol/g。

表2 不同時(shí)間冷脅迫處理對(duì)辣椒幼苗生理指標(biāo)的影響

2.2 辣椒耐冷性鑒定的適宜脅迫時(shí)間

由表3可知,不同時(shí)間冷脅迫處理辣椒6項(xiàng)生理指標(biāo)的變異系數(shù)差異較大,其中SOD活性、MDA含量和Pro含量這3項(xiàng)指標(biāo)以12 h處理的變異系數(shù)最大,分別為0.31%、0.71%、0.49%,表明12 h冷脅迫處理能較好地反映不同辣椒材料間耐冷性差異。

表3 不同時(shí)間冷脅迫處理辣椒幼苗6項(xiàng)生理指標(biāo)的變異系數(shù)

2.3 辣椒栽培種間耐冷性的差異

對(duì)4 ℃±1 ℃處理12 h的5個(gè)栽培種的生理指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果(表4)表明：3份C.annuum材料SOD活性的平均值最高(306.08 U/g)；3份C.pubescens材料POD活性的平均值最高(2508.43 U/g)；2份C.chinense的MDA含量最低(10.30 nmol/g)；3份C.pubescens材料的Pro含量比2份C.chinense材料高出8.98 μg/g；H2O2含量和OFR產(chǎn)生速率最低的栽培種分別為C.chinense和C.frutescens；3份C.pubescens材料的MDA含量比2份C.chinense材料高出39.15 nmol/g。在本研究分屬于辣椒5個(gè)栽培種的14份材料間，SOD活性、POD活性、Pro含量、H2O2含量、OFR產(chǎn)生速率均無(wú)顯著差異。

表4 冷脅迫處理12 h辣椒栽培種間生理指標(biāo)的差異

2.4 辣椒耐冷性指標(biāo)間的相關(guān)性

對(duì)冷脅迫處理12 h辣椒幼苗的6項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析,結(jié)果(表5)表明:SOD活性與POD活性呈顯著負(fù)相關(guān)(r2=-0.52*);MDA含量與POD活性呈極顯著正相關(guān)(r2=0.76**);POD活性與H2O2含量呈顯著正相關(guān)(r2=0.61*);MDA含量與Pro含量呈顯著正相關(guān)(r2=0.53*);Pro含量與H2O2含量呈極顯著正相關(guān)(r2=0.79**)；OFR產(chǎn)生速率與其他5個(gè)生理指標(biāo)間無(wú)顯著相關(guān)性。說(shuō)明冷脅迫對(duì)辣椒幼苗的生理影響是多方面的。

表5 冷脅迫處理12 h辣椒幼苗生理指標(biāo)間的相關(guān)性

2.5 辣椒材料耐冷性的綜合評(píng)價(jià)

選取SOD活性、POD活性、Pro含量、MDA含量、H2O2含量5項(xiàng)生理指標(biāo)(表6),采用隸屬函數(shù)法,對(duì)14份辣椒材料苗期的耐冷性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。由表6可知：C.annuumP70、C.annuumA270、C.chinensePI241650的平均隸屬度分別為0.63、0.59、0.58,具有較強(qiáng)的耐冷性;C.frutescensPI439521、C.baccatumPI632927、C.pubescensPI593632的平均隸屬度分別為0.43、0.46、0.46,耐冷性中等;C.pubescensPI593617的平均隸屬度為0.32,耐冷性較弱。

表6 不同辣椒材料耐冷性相關(guān)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值

2.6 辣椒幼苗耐冷性的聚類分析

采用類平均法(UPGMA),對(duì)經(jīng)4 ℃±1 ℃處理12 h的14份辣椒材料的平均隸屬度進(jìn)行聚類分析,結(jié)果如圖1所示。在歐式距離0.09處,將14份材料分為3個(gè)類別：第Ⅰ類別包括5份材料,分別為C.annuumP70、C.annuumA270、C.chinensePI241650、C.annuumA136和C.frutescensPI439512,占供試材料的35.71%,在冷脅迫處理12 h時(shí)植株表現(xiàn)為葉片下垂,無(wú)明顯失水癥狀,在冷脅迫處理24 h時(shí)植株表現(xiàn)為葉片下垂,無(wú)明顯失水癥狀;第Ⅱ類別包括C.baccatumPI632927、C.frutescensPI439521、C.chinenseGrif9238等8份材料,占供試材料的57.14%,在冷脅迫12 h時(shí)植株表現(xiàn)為葉片邊緣輕微失水,在冷脅迫24 h時(shí)表現(xiàn)為除頂部真葉外,其余真葉失水較為嚴(yán)重并出現(xiàn)水漬化現(xiàn)象,其中C.chinenseGrif9238在冷脅迫12 h、24 h時(shí)葉片出現(xiàn)褐斑;第Ⅲ類別僅包括C.pubescensPI593617這1份材料,占供試材料的7.14%,其在冷脅迫12 h時(shí)植株葉片出現(xiàn)水漬,并出現(xiàn)褐斑,在冷脅迫24 h時(shí)植株水漬化更加嚴(yán)重,褐斑增多。5個(gè)栽培種代表材料在冷脅迫后的植株表現(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 14份辣椒材料苗期耐冷性的聚類分析結(jié)果

圖2 5個(gè)辣椒栽培種代表材料在冷脅迫后的表型變化

3 小結(jié)與討論

適當(dāng)時(shí)間的冷脅迫處理是評(píng)價(jià)辣椒苗期耐冷性的一個(gè)重要因素。徐冉等以冷脅迫(15 ℃/8 ℃)處理辣椒幼苗,在冷脅迫處理10 d時(shí)辣椒幼苗的POD活性、Pro含量均達(dá)到最大值[14];經(jīng)4 ℃冷脅迫處理48 h,耐冷材料‘湘研1號(hào)’葉片中的MDA含量呈上升趨勢(shì),SOD活性高出處理前25.15%[15];經(jīng)5 ℃冷脅迫處理15 d辣椒材料‘良椒2313’的SOD活性、POD活性、Pro含量、MDA含量在4份材料中最高[16]。前人模擬低溫進(jìn)行耐冷性鑒定,通常采用單一時(shí)間處理,得到的試驗(yàn)結(jié)果對(duì)耐冷性鑒定及耐冷機(jī)制分析具有一定的局限性。本試驗(yàn)比較了辣椒苗期在冷脅迫處理中5個(gè)時(shí)間段的生理指標(biāo)變異系數(shù),發(fā)現(xiàn)在冷脅迫處理12 h時(shí),3項(xiàng)生理指標(biāo)SOD、MDA、Pro的變異系數(shù)最大,表明4 ℃±1 ℃冷脅迫處理12 h可以較好地反映出辣椒材料的耐冷性差異。

不同植物抵抗低溫的能力不同,致使低溫會(huì)對(duì)植物造成不同程度的損傷[17],嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致植株死亡。辣椒苗期在受到冷脅迫時(shí),細(xì)胞膜透性增加[18],細(xì)胞保護(hù)酶活性被抑制,從而降低對(duì)活性氧和自由基的清除,導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的增加[19]；而Pro作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠增加胞內(nèi)溶質(zhì)濃度,降低冰點(diǎn),從而降低冷害對(duì)幼苗的傷害[20]。宋靜爽等[21]以辣椒低溫敏感型C.annuum‘A122’和耐低溫型C.annuum‘A188’為試驗(yàn)材料,發(fā)現(xiàn)在4 ℃冷脅迫72 h內(nèi),其SOD活性以及Pro含量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),而POD活性和MDA含量則先升高后降低;張武君等[22]以防城普通種‘金花茶’為材料,在3 ℃下低溫脅迫處理3～12 h，發(fā)現(xiàn)SOD活性呈下降趨勢(shì),POD活性在3～6 h期間下降,在6～12 h期間上升,而Pro含量和MDA含量均呈上升趨勢(shì);對(duì)4份番茄材料進(jìn)行15 ℃/5 ℃、20 ℃/10 ℃冷脅迫處理，發(fā)現(xiàn)隨著溫度降低,番茄幼苗的SOD活性呈下降趨勢(shì),而POD活性、MDA含量、Pro含量呈上升趨勢(shì)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)：在冷脅迫處理48 h內(nèi),辣椒幼苗的SOD活性總體上呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì);POD活性在冷脅迫處理48 h內(nèi)均值都高于0 h時(shí)的;Pro含量在冷脅迫處理0～48 h期間呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì);H2O2含量在冷脅迫6 ～24 h期間呈下降趨勢(shì),在24～48 h期間升高;OFR產(chǎn)生速率始終高于0 h時(shí)的;MDA含量在冷脅迫處理6 h時(shí)達(dá)到峰值后下降。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果不盡相同,這可能與作物本身的生物學(xué)特性以及脅迫溫度和脅迫時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)。

植物的耐冷性是受多基因控制的數(shù)量性狀,耐冷機(jī)制十分復(fù)雜[24-25]。為了全面評(píng)價(jià)辣椒幼苗的耐冷性,應(yīng)結(jié)合多個(gè)指標(biāo)科學(xué)地評(píng)價(jià)幼苗的耐冷性[26]。使用隸屬函數(shù)法進(jìn)行多項(xiàng)指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)是目前普遍認(rèn)為可靠的抗逆評(píng)價(jià)方法,該方法常用于辣椒[18]、黃瓜[27]、馬鈴薯[28]等作物的抗逆性評(píng)價(jià)。苗麗等采用隸屬函數(shù)法對(duì)102份嫁接黃瓜進(jìn)行了評(píng)價(jià),篩選出‘柿餅?zāi)瞎?Bb636-3(N67)’和‘三禾13-s08z13-3(N91)’等作為優(yōu)異親本材料[29]。齊曉華等[30]采用隸屬函數(shù)法,從8份華北型黃瓜品種(系)中篩選出2份強(qiáng)耐冷的品系材料‘NY4’、‘NY5’和1份耐冷品種‘科普2號(hào)’。本實(shí)驗(yàn)室丁夢(mèng)佳等對(duì)44份辣椒材料在苗期與成株期的耐冷性進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià),篩選出耐冷材料C.annuum‘A270’[31]。在本試驗(yàn)中,C.annuum‘P70’、C.annuum‘A270’、C.chinense‘PI241650’、C.annuum‘A136’、C.frutescens‘PI439512’的平均隸屬度居前5位,在14份材料中表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐冷性。本研究實(shí)驗(yàn)材料的平均隸屬度在閉區(qū)間[0～1]范圍內(nèi),利用平均隸屬度能比較準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)辣椒的耐冷性。

辣椒是世界性蔬菜作物和調(diào)味品,生產(chǎn)上的品種基本上都是C.annuum,因此前人研究辣椒耐冷性的試驗(yàn)材料主要來(lái)自C.annuum,同時(shí)對(duì)C.annuum、C.chinense、C.baccatum、C.frutescens和C.pubescens這5個(gè)栽培種的耐冷性研究很少。本研究為了充分挖掘辣椒的耐冷基因,率先開(kāi)展了辣椒5個(gè)栽培種的耐冷性綜合評(píng)價(jià)研究,除了在C.annuum中獲得了3份耐冷材料外,還在C.chinense和C.frutescens中分別獲得了1份耐冷材料。本研究擴(kuò)大了辣椒耐冷的基因庫(kù),這對(duì)后續(xù)辣椒耐冷機(jī)制的深入研究和耐冷材料的創(chuàng)制具有積極作用。

本研究結(jié)果表明：冷脅迫處理12 h可以較好地反映出辣椒5個(gè)栽培種14份材料苗期的耐冷性差異,因此12 h為辣椒冷脅迫處理的適宜時(shí)間；POD與SOD、MDA、H2O2間,Pro與MDA、H2O2間均存在顯著相關(guān)性；用隸屬函數(shù)法對(duì)SOD、POD、MDA、Pro、H2O2這5項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),得到耐冷材料C.annuum‘P70’、C.annuum‘A270’、C.annuum‘A136’、C.chinense‘PI241650’、C.frutescens‘PI439512’。