張成玲，孫厚俊，謝逸萍，楊冬靜，馬居奎

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221131)

甘薯黑斑病是由甘薯長喙殼菌(CeratocystisfimbriataEllis et Halsted)引起的，發(fā)生在甘薯苗期、大田期、貯藏期，為害甘薯莖蔓、薯塊等，是甘薯重要的病害之一。甘薯黑斑病在全國各大薯區(qū)均有發(fā)生，每年造成產(chǎn)量損失5%～10%，發(fā)病嚴(yán)重年份或地區(qū)的產(chǎn)量損失更高。發(fā)病甘薯中產(chǎn)生的黑皰霉酮等物質(zhì)可引起家畜中毒，甚至死亡。用發(fā)病薯塊進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，能毒害酵母菌和糖化酶菌，延緩發(fā)酵過程，降低酒精產(chǎn)量和質(zhì)量[1-2]。病原C.fimbriata能侵染牽牛、綠豆、紅豆等多種植物，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。為了能更好地防治甘薯長喙殼菌，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)不同寄主來源病菌的生物學(xué)特性、基因型及病菌侵染等方面進(jìn)行了研究。2013年Simpson首先等對(duì)甘薯長喙殼菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，研究了該菌的微衛(wèi)星標(biāo)記，明確了其種群結(jié)構(gòu)和起源，開發(fā)了微衛(wèi)星標(biāo)記，以區(qū)分甘薯長喙殼菌的物種[3]。隨后Li等[4]對(duì)中國、日本、澳大利亞和美國的C.fimbriata進(jìn)行了分析，明確了這些地區(qū)來源的病菌具有相同的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列，微衛(wèi)星等位基因變異較小，甘薯與石榴上分離出的病原菌屬于同一個(gè)生物種，而桉樹上的病原菌具有典型亞洲種群特性。Scruggs等[5]利用ITS、TEF和MAT-2序列分析了美國北卡羅來納州甘薯黑斑病分離株的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)50株供試菌株均為單一交配型MAT-2，ITS、TEF與MAT-2序列的比對(duì)顯示，所有分離株在每個(gè)位點(diǎn)都是相同的。不同寄主來源的甘薯長喙殼菌對(duì)寄主的親和性不同，芋頭菌株和石榴菌株均可在芋頭塊莖組織表面生長,并最終致其腐爛，表現(xiàn)出親和反應(yīng)，但是甘薯菌株接種芋頭塊莖組織后，表面無菌絲生長，表現(xiàn)出非親和反應(yīng)[6]。但來源于甘薯的C.fimbriata對(duì)所有甘薯品種均有致病性，但不同品種的抗性表現(xiàn)差異，篩選出了如蘇薯9號(hào)、徐薯23、渝蘇76、鄂薯2號(hào)、冀薯99、煙薯18等抗性品種[5,7-9]。利用SSH技術(shù)構(gòu)建甘薯抗黑斑病材料的cDNA文庫,明確了muRdrl等抗性基因位點(diǎn)[10]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，明確了大麥硫蛋白α-hordothionin(αHT)能抑制甘薯長喙殼菌的侵染，顯著提高了甘薯的抗性[11]。

病原菌等生物脅迫可誘導(dǎo)植物體活性氧積累，對(duì)植物產(chǎn)生傷害，而植物體的保護(hù)酶系統(tǒng)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)相互協(xié)調(diào)，可清除植物活性氧，降低其對(duì)植物的傷害[12-13]。接種甘薯黑斑病菌后，甘薯塊根中過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著升高,且抗病品種的酶活力變化速度和峰值均高于感病品種,即不同甘薯品種酶活力變化與甘薯抗病性存在相關(guān)性[14]。劉美艷[15]、王景景[16]等測(cè)定了高抗黑斑病菌材料“南京-92”和高感材料“煙臺(tái)-252”塊根中綠原酸、總酚的含量、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性。抗病品種在黑斑病侵染第1天，PAL活力就迅速提高，且一直保持較高水平，綠原酸含量也迅速提高。感病品種在黑斑病侵染后第3天的PAL活力才顯著升高、第5天后迅速下降；高抗品種體內(nèi)PPO活性及總酚含量比高感品種提高迅速，且持續(xù)時(shí)間較長。盡管已有不少有關(guān)甘薯薯塊保護(hù)酶等活性變化的報(bào)道，但是甘薯黑斑病菌引起甘薯薯苗酶活力變化尚不清楚。本研究從山東濰坊采集到甘薯黑斑病樣品，經(jīng)分離鑒定后，接種到不同甘薯薯苗上，測(cè)定并分析了不同接種時(shí)間不同甘薯品種葉片SOD和POD活性變化及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，為甘薯薯苗抗逆機(jī)理的深入研究、抗性品種的篩選及培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘薯黑斑病菌甘薯長喙殼菌(C.fimbriataEllis et Halsted)為江蘇徐州甘薯研究中心從山東濰坊甘薯黑斑病發(fā)病薯塊上分離得到，命名為WF。將病原菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃活化培養(yǎng)7 d后備用。供試甘薯品種為煙薯252、沖繩100(勝利百號(hào))、南京92、徐薯273、徐薯18，均為江蘇徐州甘薯研究中心提供。從苗床中剪取生長整齊一致的健壯幼苗，篩選4葉1心，基部莖粗12～13 mm，莖長(20±2)cm，莖節(jié)3節(jié)的幼苗進(jìn)行清水培養(yǎng)。培養(yǎng)器為規(guī)格500 mL的燒杯，每瓶3株。水培期，每2 d更換1次清水，每次每瓶加300 mL。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及接種

待幼苗緩苗后，利用上述培養(yǎng)的病原菌孢子濃度為1×106CFU/mL的孢子懸浮液進(jìn)行處理30 min，移入清水中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于接種后1、6、24、72、120、168 h采集葉片。每個(gè)試驗(yàn)甘薯品種設(shè)3次重復(fù)，以清水處理為對(duì)照。

1.3 抗氧化酶活力的測(cè)定方法

POD、SOD、MDA測(cè)定試劑盒(微量法)均購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。樣品冷凍研磨后加入提取液，根據(jù)蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒使用說明，利用Thermo Scientific Multiskan GO酶標(biāo)儀，測(cè)定不同酶在特定波長下吸光值，計(jì)算其活性及含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件進(jìn)行分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯黑斑病菌脅迫下不同甘薯品種MDA含量的變化

4個(gè)甘薯品種的MDA含量隨時(shí)間的延長，抗性品種南京92和感病品種煙薯252在120 h(5 d)達(dá)到最高值，分別為121.68%和125.89%，隨后增長率逐漸減低。而徐薯273、沖繩100和徐薯18的整體增長率逐漸上升，在168 h(7 d)達(dá)到最高值。徐薯273和煙薯252接種后72 h的增長率稍低于24 h。處理初期，同一時(shí)間處理不同的甘薯品種發(fā)現(xiàn)，感病品種的MDA含量增長率明顯高于抗病品種，隨著抗性趨勢(shì)的增強(qiáng)，與感病品種增長率差異越明顯(圖1)。

圖1 甘薯黑斑病菌不同處理時(shí)間對(duì)甘薯葉片MDA含量的影響

2.2 甘薯黑斑病菌脅迫下不同甘薯品種SOD活性的變化

由圖2可知，黑斑病菌侵染甘薯后，不同甘薯品種的抗氧化酶SOD活性隨時(shí)間的推移，其增長趨勢(shì)不同，抗性品種南京92呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢(shì)，在6 h時(shí)增長率最高，達(dá)到116.35%；徐薯18在1 h時(shí)增長率最高，為89.48%，隨后下降，到168 h時(shí)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。徐薯273、沖繩100及煙薯252的增長率整體呈現(xiàn)下降上升再下降趨勢(shì)。SOD活性隨著處理時(shí)間的推移，無論是正增長還是負(fù)增長，高抗品種南京92的增長率高于其他品種。

圖2 甘薯黑斑病菌不同處理時(shí)間對(duì)甘薯葉片SOD活性的影響

2.3 甘薯長喙殼菌脅迫下不同甘薯品種POD活性的變化

POD普遍存在于高等植物中，能夠催化分解由SOD清除自由基所產(chǎn)生的H2O2和過氧化物，在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用。由圖3可知，所有甘薯品種抗氧化酶POD活性隨侵染時(shí)間的增長而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，隨后增長率下降，除徐薯273在6 h時(shí)達(dá)到最高值，為302.72%，高于其他甘薯品種，其余品種均在24 h時(shí)的增長率最高。同一時(shí)間處理不同的甘薯品種，高抗性品種南京92的POD活性的增長率明顯高于其他品種，且隨著不同品種的抗性變化，其增長率變化也不同。

圖3 甘薯黑斑病菌不同處理時(shí)間對(duì)甘薯葉片POD活性的影響

3 小結(jié)與討論

植物受到脅迫時(shí)，活性氧動(dòng)態(tài)平衡被打破，產(chǎn)生大量的活性氧，促使植物脂膜和細(xì)胞器膜的嚴(yán)重過氧化，MDA含量升高。為抵御這種脅迫，植物啟動(dòng)膜保護(hù)系統(tǒng)又稱為抗氧化系統(tǒng)來清除植物體內(nèi)多余的自由基。POD、SOD酶是植物體內(nèi)主要的抗氧化酶，其活力的大小及變化趨勢(shì)反映了植物抗性的強(qiáng)弱[12-13]。

不同甘薯品種薯苗接種甘薯黑斑病菌后，體內(nèi)MDA及抗氧化酶活力性變化不同。不同甘薯品種接種病菌后，體內(nèi)MDA含量的變化隨時(shí)間的增長整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，抗性品種南京92和感病品種煙薯252在120 h(5 d)達(dá)到最高值，隨后下降。處理初期，同一時(shí)間處理不同的甘薯品種發(fā)現(xiàn)，感病品種MDA增長率明顯高于抗病品種，隨著抗性趨勢(shì)的增強(qiáng)，與感病品種增長率差異越明顯抗氧化酶SOD隨時(shí)間推移增長趨勢(shì)呈現(xiàn)先上升后下降，在72 h時(shí)除沖繩100是增長，其余品種均為負(fù)增長。SOD隨著處理時(shí)間推移，無論是增長還是負(fù)增長，感病品種增長率低于抗性品種?？寡趸窹OD隨時(shí)間增長呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，隨后增長趨勢(shì)下降，同一處理時(shí)間不同抗性品種，增長率不同，除處理6 h的徐薯273增長率高于其他品種，高抗品種南京92增長率高于其他品種，表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，甘薯黑斑病菌侵染甘薯薯苗后，抗氧化酶活力增長率與品種抗性呈正比，MDA含量變化也反映了甘薯薯苗抗性強(qiáng)弱。