王曉玉，孟 楣，陳 浩，程 蕤，魏 芳

五味骨疽拔毒散是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科在十余年臨床實踐基礎(chǔ)上研制的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑品種(批準(zhǔn)文號：皖藥制字Z20090007)，處方由山藥、生天南星、玄明粉、白礬、冰片五味中藥組成，共奏消腫提毒之功效。臨床上適用于急慢性骨髓炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、骨結(jié)核、骨腫痛和瘀熱內(nèi)阻型骨性關(guān)節(jié)炎的治療[1]。該制劑臨床療效確切，受到病人廣泛好評。處方中山藥外用具有利濕消腫作用；白礬研末外敷能夠消腫止痛、清熱解毒，治療腫惡瘡；玄明粉外用具有清熱解毒消腫之用；生天南星多入丸散用，外敷能散結(jié)消腫止痛，可用治癰疽痰核腫瘤和勞損；冰片外用有清火止痛、止癢、防腐之功效。諸藥入散合用，共湊清熱利濕、解毒、消腫，散結(jié)止痛之功效[2]。本試驗在前期研究的基礎(chǔ)上，建立五味骨疽拔毒散的顯微鑒別、薄層鑒別及含量測定方法作為該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，從而保證該制劑臨床應(yīng)用的有效性和安全性。

1 材料與方法

1.1 材料 日本OLYMPUS公司的BX43型電子顯微鏡；德國SARTORIUS公司的BP211D型十萬分之一電子天平；瑞士CAMAG公司的定量毛細(xì)管；青島海洋化工有限公司的薄層硅膠G板；常州榮華儀器制造有限公司的HH-6型恒溫水浴鍋；德國西門子公司的BCD-277型電冰箱；深圳美加麗實驗室裝備有限公司TF-18通風(fēng)櫥；上海科導(dǎo)公司的SK3200H型超聲清洗器；酸式滴定管等。安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供的五味骨疽拔毒散(批號：20190311、20190506、20190710)；山藥、生天南星、白礬、冰片、玄明粉藥材(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院草藥房，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)周建理教授鑒定)；薯蕷皂苷元對照品(批號111707-201402，中國食品藥品鑒定研究院)；乙酸銨(分子式CH3COONH4，分析純，含量≥98%，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；乙二胺四乙酸二鈉滴定液標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05 mol/L，福建廈門海標(biāo)科技有限公司)；鋅滴定液標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05 mol/L，福建廈門海標(biāo)科技有限公司)；二甲酚橙(分子式C31H28N2Na4O13S，分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；十二水合硫酸鋁鉀[分子式KAl(SO4)2·12H2O，中國食品藥品鑒定研究院]，三氯甲烷、甲醇等為分析純；水為屈臣氏純凈水。

1.2 方法

1.2.1 顯微鑒別

1.2.1.1 五味骨疽拔毒散中山藥的顯微鑒別 查閱相關(guān)文獻(xiàn)和預(yù)實驗，五味骨疽拔毒散中山藥的顯微鑒別中有明顯的顯微鑒別特征：草酸鈣針晶成束存在于黏液細(xì)胞中[3]。因此，針對此鑒別特征，我們對三批五味骨疽拔毒散樣品進(jìn)行了顯微觀察。分別稱取五味骨疽拔毒散三批(批號：20190311、20190506、20190710)粉末少許，備用。依據(jù)五味骨疽拔毒散處方量同比縮小稱取除山藥外，五味骨疽拔毒散方中其他藥材，按五味骨疽拔毒散的制備工藝制備缺山藥的陰性樣品粉末。采用粉末制片法(現(xiàn)行版中國藥典通則2001)，分別將少許五味骨疽拔毒散樣品置載玻片上，滴加水合氯醛加熱透化后，制片，置光學(xué)顯微鏡下觀察樣品粉末中山藥草酸鈣結(jié)晶的顯微特征。

1.2.1.2 五味骨疽拔毒散中生天南星的顯微鑒別 通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4]和預(yù)實驗，五味骨疽拔毒散中生天南星有明顯的顯微鑒別特征：草酸鈣針晶。因此，針對鑒別特征，我們對三批樣品進(jìn)行了顯微觀察。稱取五味骨疽拔毒散三批(批號：20190311、20190506、20190710)粉末少許，備用。依據(jù)五味骨疽拔毒散處方量同比縮小稱取除生天南星外的其他藥材，按五味骨疽拔毒散的制備工藝制備缺天南星的陰性樣品粉末。采用粉末制片法(現(xiàn)行版中國藥典通則2001)，分別置載玻片上，滴加水合氯醛后加熱透化，制片，置光學(xué)顯微鏡下觀察樣品粉末中生天南星草酸鈣結(jié)晶的顯微特征。

1.2.2 薄層色譜鑒別

1.2.2.1 五味骨疽拔毒散中山藥的薄層色譜鑒別 取三個批號的本品粉末各1 g，分別加入20 mL的甲醇，置超聲儀中，進(jìn)行超聲處理(30 min)，用玻璃漏斗過濾，將濾液蒸干。殘渣加入1 mL的三氯甲烷-甲醇(1∶1)的混合溶液，使其溶解，作為五味骨疽拔毒散供試品溶液。取按五味骨疽拔毒散處方比例及制備工藝要求制成的不含山藥的五味骨疽拔毒散陰性對照樣品，同法制成陰性對照溶液[5]。取薯蕷皂苷元對照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作為薯蕷皂苷元對照品溶液。參照薄層色譜法(現(xiàn)行版中國藥典通則0502)進(jìn)行試驗，吸取五味骨疽拔毒散供試品溶液、薯蕷皂苷元對照品溶液、缺山藥的五味骨疽拔毒散陰性對照溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板(規(guī)格：10 cm×10 cm)上，展開劑為三氯甲烷-甲醇(20∶0.2)，靜置展開，取出，室溫晾干，均勻噴以10%的磷鉬酸乙醇溶液，置電加熱板上加熱(105 ℃，5 min)。

1.2.2.2 五味骨疽拔毒散中冰片的薄層色譜鑒別[6]取三批五味骨疽拔毒散樣品各2 g，分別加40 mL的石油醚(30～60 ℃)，持續(xù)振搖(5 min)，用玻璃漏斗過濾，濾液濃縮至1 mL，作為五味骨疽拔毒散供試品溶液。取按五味骨疽拔毒散處方比例及制備工藝要求制成的不含冰片的五味骨疽拔毒散陰性對照樣品，同法制成缺冰片的五味骨疽拔毒散陰性對照溶液。另取冰片對照品，加入石油醚(30～60 ℃)，制成4 mg/mL的溶液，作為冰片對照品溶液。參照薄層色譜法(現(xiàn)行版中國藥典通則0502)進(jìn)行試驗，吸取五味骨疽拔毒散供試品溶液、缺冰片的五味骨疽拔毒散陰性對照溶液和冰片對照品溶液各2 μL，分別點于同一塊硅膠G薄層板(規(guī)格：10 cm×10 cm)上，展開劑乙酸乙酯-環(huán)己烷(3∶17)，靜置展開，取出，室溫晾干，均勻噴以5%的香草醛硫酸溶液，置電加熱板上加熱(105 ℃)，至斑點顯色清晰，與冰片對照品斑點進(jìn)行比較。

1.2.3 五味骨疽拔毒散中白礬含量測定[7]

1.2.3.1 溶液的配制 稱取54.6 g乙酸鈉，用20 mL的1 mol/L乙酸溶液進(jìn)行溶解后，加水稀釋到500 mL，即得乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 6.0)。稱取0.2 g的二甲酚橙，加入100 mL的水，使其溶解，即得二甲酚橙指示液(本液必須臨制)。

1.2.3.2 測定方法 參照現(xiàn)行版藥典白礬項下含量測定方法及預(yù)實驗，精密稱取五味骨疽拔毒散2 g，加40 mL的水進(jìn)行溶解后，用玻璃漏斗進(jìn)行過濾，取續(xù)濾液20 mL，加入20 mL pH 6.0乙酸-乙酸銨緩沖液，精密加入25 mL的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二鈉，煮沸3～5 min，放置冷卻，滴加1 mL的二甲酚橙指示液，用0.05 mol/L的鋅滴定液進(jìn)行滴定，直至溶液從黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，并滴定結(jié)果用空白試驗校正(空白試驗同為兩份)。每1 mL的乙二胺四乙酸二鈉相當(dāng)于23.72 mg的十二水合硫酸鋁鉀。

計算公式：

V：空白消耗滴定液體積(mL)

Vn：消耗鋅滴定液體積(mL)

Mn：稱取樣品重量(g)

F：乙二胺四乙酸二鈉校正系數(shù)

1.2.3.3 專屬性考察 按五味骨疽拔毒散處方比例做缺白礬的陰性樣品，按 “1.2.3.2”項下測定方法取本品適量，測定三批陰性樣品。

1.2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密稱取十二水合硫酸鋁鉀0.1018、0.2008、0.3006、0.4006、0.5005，置于250 mL錐形瓶中，按“1.2.3.2”項下方法測定，記錄消耗乙二胺四乙酸二鈉滴定液的毫升數(shù)。以十二水合硫酸鋁鉀對照品稱取量為橫座標(biāo)，以消耗乙二胺四乙酸二鈉滴定液的毫升數(shù)為縱座標(biāo)，進(jìn)行回歸處理。

1.2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密稱定五味骨疽拔毒散(批號：20190506)5份制備供試品，按“1.2.3.2”項下測定方法，分別放置0、2、4、6、10 h后測定各不同時間點的含量。

1.2.3.6 重復(fù)性試驗 取同一批號五味骨疽拔毒散(批號：20190506)6份各2 g，精密稱定，按“1.2.3.2”項下測定方法測定。

1.2.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取6份已知白礬含量的五味骨疽拔毒散樣品適量，分別精密加入十二水合硫酸鋁鉀對照品適量，按“1.2.3.2”項下測定方法制備五味骨疽拔毒散供試品溶液并測定。

2 結(jié)果

2.1 顯微鑒別

2.1.1 五味骨疽拔毒散中山藥的顯微鑒別 三批五味骨疽拔毒散樣品均可觀察到山藥草酸鈣針晶，山藥草酸鈣針晶成束存在于黏液細(xì)胞中，長約240 μm，且缺山藥的陰性對照無干擾(見圖1)。

2.1.2 五味骨疽拔毒散中生天南星的顯微鑒別 三批樣品均可觀察到生天南星草酸鈣針晶，草酸鈣針晶散在或成束存在于黏液細(xì)胞中，長度63～100 μm，且缺天南星的陰性對照無干擾(見圖2)。

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 五味骨疽拔毒散中山藥的薄層色譜鑒別 五味骨疽拔毒散供試品薄層色譜中，在薯蕷皂苷元對照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯現(xiàn)相同的深藍(lán)色斑點，而缺山藥的五味骨疽拔毒散陰性對照色譜中無相應(yīng)斑點(見圖3)。

2.2.2 五味骨疽拔毒散中冰片的薄層色譜鑒別 五味骨疽拔毒散供試品色譜中，在冰片對照品薄層色譜相應(yīng)的位置上，均呈現(xiàn)相同的紫紅斑點，缺冰片的五味骨疽拔毒散陰性對照無干擾(見圖4)。

2.3 五味骨疽拔毒散中白礬含量測定

2.3.1 方法學(xué)考察 以十二水合硫酸鋁鉀對照品稱取量為橫座標(biāo)，以消耗乙二胺四乙酸二鈉滴定液的毫升數(shù)為縱座標(biāo)，進(jìn)行回歸處理，得線性回歸方程：Y=43.435X-0.453 1，r=0.999 1(n=5)，結(jié)果表明該方法在0.101 8～0.500 5 g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；五味骨疽拔毒散處方中其他藥材及輔料對滴定終點無影響，該方法專屬性好；穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.129%、0.197%；平均回收率為98.90%，RSD為0.129%。結(jié)果表明方法均表現(xiàn)良好。

2.3.2 樣品含量測定與含量限度的確定 取三批五味骨疽拔毒散(批號：20190311、20190506、20190710)中白礬含量分別為298.30、292.29、301.40 mg/g。

本研究建立的滴定法測定五味骨疽拔毒散處方中白礬含量三批樣品(批號：20190311、20190506、20190710)中白礬的含量測定結(jié)果為292.29～301.40 mg/g，根據(jù)《中國藥典》2015年版一部“白礬”項下白礬中十二水合硫酸鋁鉀的含量限度為99%，結(jié)合實際生產(chǎn)中的藥材粉末間的吸附損耗及制劑過程中的損失量，因此，暫將含量測定項標(biāo)準(zhǔn)訂為：本品中每g含白礬以十二水合硫酸鋁鉀計，不得少于200 mg。

3 討論

3.1 定性鑒別指標(biāo)的選擇 本文參考《中國藥典》2015年版及文獻(xiàn)資料，綜合考慮用顯微鑒別方法比較方便、快捷，更適合散劑的質(zhì)量控制。因此，選取五味骨疽拔毒散方中的2味藥材進(jìn)行顯微研究。山藥的顯微特征是淀粉粒、草酸鈣針晶、導(dǎo)管、篩管、纖維等。天南星的顯微特征是淀粉粒、草酸鈣針晶、草酸鈣方晶、導(dǎo)管、棕色塊等。兩種藥材雖然都含有淀粉粒和導(dǎo)管，但淀粉粒、導(dǎo)管不能作為區(qū)別兩種藥材的特征。由于山藥中篩管、纖維不易尋找，因此山藥區(qū)別與天南星的主要特征是草酸鈣針晶。雖然兩種藥材都含有草酸鈣針晶，但二者有明顯差異，天南星的草酸鈣針晶單個散在或成束，或成束存在于橢圓形黏液細(xì)胞中，長63～131 μm[6]；山藥的草酸鈣針晶成束存在于黏液細(xì)胞中，長約240 μm[6]；草酸鈣針晶可作為區(qū)別二者的特征。且陰性對照無干擾，方法簡單、重復(fù)性好。依法檢查本品三批，均檢出山藥及天南星的草酸鈣針晶。因此，本方法可用來作為山藥及天南星的顯微鑒別方法，故建議納入五味骨疽拔毒散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。

3.2 含量測定指標(biāo)的選擇 五味骨疽拔毒散是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科在較大樣本的中醫(yī)癥候調(diào)查和預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，以急慢性骨髓炎、骨結(jié)核、骨腫痛、化膿性關(guān)節(jié)炎為常見的疾病，其所具有的“外邪侵襲，正氣不足，痰瘀互結(jié)”這一中醫(yī)的基本病機(jī)，故選擇具有“補(bǔ)脾養(yǎng)胃，生津益肺，解毒殺蟲，燥濕止癢”之功效的組方而來，經(jīng)過十余年的臨床研究表明，其具有良好的消腫提毒作用。本方立論有據(jù)，組方用藥合理，精確，制劑質(zhì)量可控，體現(xiàn)了中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)以辨證論治為主的優(yōu)良與特色，具有較好的臨床應(yīng)用前景。 含量測定是中藥質(zhì)量控制中重要的內(nèi)容[8-9]。根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局《中藥制劑質(zhì)量及穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》規(guī)定，以檢測方中君臣藥，貴重藥和毒劇藥為主的原則。五味骨疽拔毒散是由山藥、白礬、玄明粉、生天南星、冰片組成，具有消腫提毒，用于急慢性骨髓炎、骨結(jié)核、骨腫痛、化膿性關(guān)節(jié)炎和瘀熱內(nèi)阻型骨性關(guān)節(jié)炎等癥。山藥為方中君藥，其含有薯蕷皂苷、淀粉、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種化合物[10-11]，通過查閱文獻(xiàn)及2015版中國藥典，薯蕷皂苷是山藥中重要的活性成分，具有多種藥理作用，我們對其采用HPLC法進(jìn)行測定，但結(jié)果表明本制劑中薯蕷皂苷成分含量過低，遂不進(jìn)行后續(xù)含量測定研究。白礬為方中臣藥，具有解毒殺菌，去濕止癢之功效。在白礬的含量測定方法研究中，因鋁離子與乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合反應(yīng)緩慢且絡(luò)合后鋁離子易水解，不能采取直接滴定法[7]。本研究采用返滴定法，加入過量乙二胺四乙酸二鈉與金屬離子充分反應(yīng)后再滴定剩余乙二胺四乙酸二鈉，同時為了消除酸性介質(zhì)中對二甲酚橙指示劑的封閉作用，本法加入了乙酸緩沖液來進(jìn)行試驗。本研究結(jié)果表明，返滴定法測定方中白礬含量重復(fù)性較好，準(zhǔn)確度高，同時操作簡便，儀器簡單，適用于五味骨疽拔毒散方中白礬含量的質(zhì)量控制。