黃蕾，劉新國(guó)，程璐，黃文濤，胡松

(武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022)

黃連降脂合劑由經(jīng)驗(yàn)效方與現(xiàn)代制劑技術(shù)相結(jié)合研制而成，由黃連、葛根、天麻、陳皮、法半夏、三七粉組成，組分獨(dú)特，具有燥濕化痰、活血化瘀功效，用于高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病，療效顯著，是我院長(zhǎng)期院內(nèi)經(jīng)驗(yàn)效方，經(jīng)長(zhǎng)期用藥觀察，該效方對(duì)心血管疾病有較好療效。在前期對(duì)君藥黃連含量測(cè)定的基礎(chǔ)上，筆者在本研究增加質(zhì)控，進(jìn)一步完善黃連降脂合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 ME215S型電子分析天平(Sartorius公司，感量：0.01 mg)；Essentia LC-16型高效色譜儀(日本島津公司)；超純水儀(上?；莘挚茖W(xué)分析儀器有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；硅膠板(青海海洋化工廠分廠)。

1.2試藥 黃連降脂合劑(武漢市第一醫(yī)院制劑中心，批準(zhǔn)文號(hào)：鄂藥制字Z20200014，批號(hào)：2017052200，2017052300，2017052400)；葛根素對(duì)照品(批號(hào)：110752-201615，含量：95.4%)、鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)：110713-201212)、三七對(duì)照藥材(批號(hào)：120941-200304)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher公司)；其他試劑為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1黃連薄層色譜鑒別

2.1.1供試品溶液的制備 取本品，搖勻，取50 mL，用三氯甲烷振搖提取2次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3陰性溶液的的制備 取不含黃連藥材的樣品50 mL，按供試品溶液制備的相同方法，制成陰性對(duì)照溶液。

2.1.4鑒別 照薄層色譜法(2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則0502)實(shí)驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10：6：1：1)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外燈(波長(zhǎng)365 nm)下檢視[1-2]。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無相應(yīng)的斑點(diǎn)，見圖1。

1.黃連降脂合劑(17052200)；2.黃連降脂合劑(17052300)；3.黃連降脂合劑(17052400)；4.鹽酸小檗堿對(duì)照品；5.缺黃連陰性對(duì)照品。

2.2三七的薄層鑒別

2.2.1供試品溶液的制備 取本品，搖勻，取80 mL，用三氯甲烷振搖提取2次，每次50 mL，棄去三氯甲烷液，水液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次50 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次50 mL，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次50 mL，棄去水洗液，正丁醇液蒸至近干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 取三七對(duì)照藥材1.0 g，加水5 mL潤(rùn)濕，與“2.2.1”項(xiàng)自“用水飽和的正丁醇振搖提取2次”起，同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.2.3陰性溶液的制備 取不含三七藥材的樣品80 mL，按供試品溶液制備的相同方法，制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.4鑒別 照薄層色譜法(2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則0502)實(shí)驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)10 ℃以下放置分層的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同顏色的斑點(diǎn)[3-4]。陰性對(duì)照無相應(yīng)的斑點(diǎn)，見圖2。

1.黃連降脂合劑(17052200)；2.黃連降脂合劑(17052300)；3.黃連降脂合劑(17052400)；4.三七對(duì)照藥材；5.缺三七陰性對(duì)照品。

2.3黃連降脂合劑中葛根素的含量測(cè)定

2.3.1色譜條件 《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部關(guān)于“葛根”項(xiàng)下藥材的含量測(cè)定方法，筆者對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行篩選，比較改變流動(dòng)相比例后，根據(jù)色譜峰的變化，最終確定色譜條件，色譜柱：C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇-水(25：75)，檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣：10 μL，理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。在此條件下，樣品中葛根素與其他組分能夠達(dá)到基線分離，與相鄰的色譜峰分離度>1.5，葛根素的理論板數(shù)>5000[5-7]。

2.3.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葛根素14.23，14.70 mg，分別置10 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，再精密量取1 mL，分別置20 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.3.3供試品溶液的制備 取本品(批號(hào)：17052200)，搖勻，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)孔徑0.45 μm濾網(wǎng)濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3.4陰性溶液的制備 按處方量稱取除葛根以外其余5味藥材，加水10倍量，浸泡1.5 h，煎煮提取2次，每次1 h，濾過，合并濾液，將濾液加熱濃縮至相對(duì)密度為1.04～1.08(40 ℃)。稱取苯甲酸鈉0.6 g，加水10 mL煮沸使溶解，加入上述濃縮液中，以純化水調(diào)整全量至200 mL，搖勻，濾過，按“2.3.3”項(xiàng)葛根供試品溶液制法制備即得。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1專屬性實(shí)驗(yàn) 在選定的色譜條件下，分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，有相同保留的色譜峰，而陰性溶液在此保留時(shí)間無干擾，見圖3。

2.4.2線性關(guān)系實(shí)驗(yàn) 精密稱取葛根素14.23 mg，置于10 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(1.36 mg·mL-1)，分別精密移取此儲(chǔ)備液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置10 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣10 μL，分別進(jìn)樣2次，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均峰面積，以平均峰面積、對(duì)照品含量計(jì)算線性回歸方程：Y=5 239 190.5X-17 542.4，r=0.999 9；表明葛根素在27.15～135.75 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3精密度實(shí)驗(yàn) 取葛根素對(duì)照品溶液，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果RSD為0.04%。

2.4.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取黃連降脂合劑樣品(批號(hào)：17052200)搖勻，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，結(jié)果RSD為1.05%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

A.陰性樣品；B.對(duì)照品；C.供試品；1.葛根素。

2.4.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取黃連降脂合劑樣品(批號(hào)：17052200)6瓶，搖勻，分別精密量取1 mL，分別置于100 mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，分別進(jìn)樣10 μL，按上述色譜條件測(cè)定葛根素的平均含量為6.99 mg·mL-1，RSD為1.47%。

2.4.6回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量樣品(批號(hào)：17052200)6份，搖勻，精密量取0.5 mL，分別置于100 mL量瓶中，精密稱取葛根素35.58 mg，置10 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密移取此儲(chǔ)備液1.0 mL，分別置100 mL量瓶中，加30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，分別進(jìn)樣10 μL，按上述色譜條件測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為97.00%，RSD為1.62%，見表1。

表1 黃連降脂合劑加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.7耐用性實(shí)驗(yàn) 取本品(批號(hào)：17052200)，搖勻，分別精密量取1 mL，分別置于100 mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，分別進(jìn)樣10 μL，在3根不同的色譜柱上測(cè)定葛根素的含量，結(jié)果表明葛根素在3根不同的色譜柱上測(cè)定結(jié)果無明顯差異，見表2。

表2 不同色譜柱測(cè)定葛根素含量結(jié)果

2.5樣品測(cè)定結(jié)果 取不同批次的黃連降脂合劑樣品各1 mL，按“2.3.3”方法制備供試品溶液，分別吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量，平均含量為7.01 mg·mL-1，最低濃度為6.51 mg·mL-1，綜合平均濃度和最低含量批次基礎(chǔ)上，下浮30%，暫擬定本品的含量限度為每毫升含葛根以葛根素(C21H20O9)計(jì)，不得少于4.56 mg，結(jié)果見表3。

表3 3批黃連降脂合劑樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1含量測(cè)定指標(biāo)的選擇 為體現(xiàn)中藥制劑在中醫(yī)理論指導(dǎo)下的組方配伍原理，制劑質(zhì)量標(biāo)志物的確定應(yīng)遵循組方配伍，以君藥為主，臣、佐、使藥兼顧的原則[8]。黃連降脂合劑處方中君藥黃連應(yīng)作為含量測(cè)定的指標(biāo)性成分，前期對(duì)君藥黃連相關(guān)成分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示黃連中主要成分轉(zhuǎn)移率分別為：表小檗堿12.96%、黃連堿10.64%、巴馬汀15.67%、小檗堿13.77%，表明水提方法對(duì)黃連生物堿類提取效率較低，這些在水中溶解性較差的成分難以成為全方水提效果的衡量指標(biāo)，因此未予采用。葛根作為臣藥在處方中用量最大(42.25%)，用HPLC法測(cè)定其中所含有效成分葛根素含量的方法成熟準(zhǔn)確，參考有關(guān)文獻(xiàn)，擬定用HPLC法對(duì)葛根素進(jìn)行含量測(cè)定，并進(jìn)行方法學(xué)研究及3批供試品的含量測(cè)定，結(jié)果表明葛根素在27.15～135.75 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，3批樣品含量測(cè)定結(jié)果均在擬定的含量限度內(nèi)，證明該方法穩(wěn)定可行，故將該指標(biāo)收載入含量測(cè)定項(xiàng)下。

3.2薄層色譜鑒別的選擇 對(duì)黃連降脂合劑除葛根以外的藥味，逐一分析薄層色譜鑒別。黃連以鹽酸小檗堿對(duì)照品，進(jìn)行薄層色譜鑒別，分離效果較好，供試品與對(duì)照品在相應(yīng)的位置上顯相同顏色的黃色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，方法可行，故納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。三七以三七對(duì)照藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別，分離效果較好，供試品色譜與對(duì)照藥材在相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，方法可行，故納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。天麻以天麻素對(duì)照品進(jìn)行薄層色譜鑒別，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，主斑點(diǎn)不明顯，且與其他斑點(diǎn)未分離，陰性對(duì)照有干擾，方法不可行，故未納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。甘草主要化學(xué)成分為甘草甜素、甘草次酸、甘草苷等，法半夏在2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》中鑒別成分為甘草次酸，二者所含成分相互干擾，因此甘草、法半夏兩味藥材的薄層色譜未納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。