李旭陽(yáng),張東偉,趙宏月

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院沈本醫(yī)院內(nèi)二科，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

心肌缺血再灌注損傷是心臟在經(jīng)受較長(zhǎng)時(shí)間的缺血后血液再灌注的一種不可逆的損傷，目前研究認(rèn)為此病的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致氧自由基異常增多、物質(zhì)代謝改善、細(xì)胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)損傷和線粒體功能障礙等一系列的病理變化，上述病理變化相互影響，最終會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡作用[1-2]。目前臨床對(duì)于抑制線粒體過(guò)度自噬的干預(yù)藥物較多，但效果并不理想。黃芪甲苷屬于中藥黃芪的主要有效成分，也是黃芪多糖的主要成分，有研究表明[3]，黃芪甲苷可在一定程度上對(duì)糖尿病腎病腎臟起到保護(hù)作用，能夠通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制，一方面可抑制細(xì)胞凋亡，另一方面還可抑制炎癥反應(yīng)。但目前臨床上對(duì)于黃芪甲苷對(duì)心肌線粒體自噬的影響機(jī)制并不完全明確，因此在本文研究中運(yùn)用黃芪甲苷對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡以及線粒體自噬的影響，為臨床上黃芪甲苷的應(yīng)用提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取SPF級(jí)75只SD健康雄性大鼠，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，體質(zhì)量220～250 g。所有大鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫在(22.1±1.8)℃，相對(duì)濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時(shí)間1周。本文研究所做實(shí)驗(yàn)均獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

主要試劑：黃芪甲苷(液體狀；純度≥98%，南京春秋生物工程有限公司，CAS號(hào)：84687-43-4)；小鼠抗大鼠Bcl-2抗體(上海信帆生物科技有限公司，貨號(hào)：XFC1532)、小鼠抗大鼠Bax抗體(上?？泼羯锟萍加邢薰?，貨號(hào)：DXT-STB12011)、小鼠抗大鼠Caspase-3抗體(上海恒斐生物科技有限公司，貨號(hào)：bs-0081R-1)，兔抗大鼠PINK1抗體(廈門研科生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：YKA-AF1830a)、兔抗大鼠Parkin抗體(上海恒斐生物科技有限公司，貨號(hào)：bs-1865R-1)、兔抗人p62抗體(武漢博歐特生物科技有限公司，貨號(hào)：orb89844)、兔抗人LC3抗體(上海恒斐生物科技有限公司，貨號(hào)：K000467P)。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模及給藥

選取75只大鼠,10只作為空白組，其余大鼠建立心肌缺血再灌注模型。參照吳宥熹等[4]研究實(shí)驗(yàn)方法建立心肌缺血再灌注模型。在建模前所有大鼠均禁食，使用75 mg/kg的戊巴比妥鈉注射于大鼠腹腔行麻醉處理后采取仰臥位將大鼠固定于操作臺(tái)上，大鼠四肢插入針狀電極，之后使用標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)對(duì)大鼠心電圖進(jìn)行記錄。連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，將大鼠胸骨左緣肌肉組織鈍性分離后將第四肋骨切斷后將心包膜剪開，暴露出冠狀動(dòng)脈左前降支，之后使用無(wú)創(chuàng)縫合絲線在左心耳下方左前降支起始段下2～3 mm處進(jìn)行進(jìn)針處理，在動(dòng)脈圓錐處進(jìn)行出針處理，之后將左冠狀動(dòng)脈左前降支行結(jié)扎處理以引起缺血，以Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段明顯抬高大于0.1 mV或T波高聳，心肌顏色變暗紅色為結(jié)扎成功。在缺血處理后的30 min后，再灌注120 min，ST段下降為再灌注成功的標(biāo)志。建模過(guò)程中2只大鼠死亡，4只大鼠因心電圖ST段無(wú)變化導(dǎo)致建模失敗，最終建模成功64只，將建模成功的64只大鼠分為模型組、低、中、高劑量組各16只。建模成功后，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠腹腔注射1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg的黃芪甲苷，每日1次，共干預(yù)1周，空白組和模型組不做任何處理。

1.2.2 病理組織學(xué)觀察

在給藥干預(yù)結(jié)束后隨機(jī)選取各組中1只大鼠采用斷頭法處死，取心肌組織，4%多聚甲醛進(jìn)行固定、脫水透明，浸蠟包埋，脫蠟、HE染色，脫水、透明，待封片晾干后在顯微鏡下觀察大鼠心肌組織病理學(xué)表現(xiàn)。

1.2.3 心肌酶檢測(cè)

在給藥干預(yù)結(jié)束后使用30 mg/kg的戊巴比妥鈉注射于各組剩余15只大鼠腹腔行麻醉處理，取腹主動(dòng)脈血1 mL，3 000 r/min離心10 min，將血清分離出，之后使用ENCOREIO0型自動(dòng)生化分析儀對(duì)各組大鼠乳酸脫氫酶(LDH)、心肌磷酸肌酸激酶(CK)以及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)等心肌酶進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 心肌梗死面積檢測(cè)

在心肌酶檢測(cè)完成后隨機(jī)選取各組中3只大鼠采用斷頭法處死，迅速取大鼠心臟，行TTC染色以明確未梗死與梗死心肌，其中未梗死區(qū)為紅色、梗死區(qū)為白色，之后采用BI-2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算大鼠心肌梗死面積。

1.2.5 心肌細(xì)胞凋亡情況、心肌細(xì)胞自噬體數(shù)量檢測(cè)

在給藥干預(yù)結(jié)束后隨機(jī)選取各組中6只大鼠采用斷頭法處死，迅速取大鼠心肌組織，4%多聚甲醛固定24 h后行常規(guī)石蠟包埋，沿心臟橫軸連續(xù)切片，液氮中冰凍保存。其中3份使用TUNEL法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，另外3份檢測(cè)心肌細(xì)胞自噬體數(shù)量。心肌細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)：取液氮中冰凍的切片行脫蠟處理，使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌，之后將50 μL的TUNEL檢測(cè)液加入，在溫度為30 ℃的避光環(huán)境下孵育1 h，再次使用磷酸鹽緩沖液洗滌，在熒光顯微鏡下對(duì)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，之后計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100。心肌細(xì)胞自噬體數(shù)量檢測(cè)：使用電鏡觀察各組大鼠心肌細(xì)胞自噬體數(shù)量，取液氮中冰凍的切片使用枸櫞酸鉛、醋酸雙氧鈾行雙重染色，之后使用透射電鏡觀察各組心肌細(xì)胞自噬體結(jié)構(gòu)，并拍照，使用計(jì)算1個(gè)銅網(wǎng)孔內(nèi)自噬體數(shù)量，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)3個(gè)銅網(wǎng)孔內(nèi)自噬體數(shù)量，取平均值。

1.2.6 Bcl-2、Bax、Caspase-3、PINK1/Parkin通路蛋白檢測(cè)

使用Western blot檢測(cè)各組大鼠心肌線粒體中PINK1/Parkin通路蛋白表達(dá)量，在給藥干預(yù)結(jié)束后處死各組中剩余的6只大鼠，采用斷頭法處死，迅速取大鼠心肌組織，液氮冰凍后研磨，研磨后加入蛋白緩沖液，進(jìn)行常規(guī)蛋白提取，采取BCA法進(jìn)行定量分析。50 μg的蛋白樣品上樣后SDS-PAGE電泳，通過(guò)蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜，使用5%的脫脂奶粉TBST進(jìn)行避光封閉1 h，洗滌之后加入一抗稀釋溶液(Bcl-2、Bax、Caspase-3、PINK1、PINK1、p62、LC3Ⅱ按照1∶1 000比例進(jìn)行稀釋)，在4 ℃的環(huán)境中過(guò)夜保存，洗滌后加入二抗稀釋溶液(Bcl-2、Bax、Caspase-3、PINK1、PINK1、p62、LC3Ⅱ按照1∶5 000比例進(jìn)行稀釋)，在溫床中孵育1h后再次洗滌，加入發(fā)光液ECL，曝光2～3次，取重疊值。使用軟件分析蛋白條帶灰度值。設(shè)置內(nèi)參蛋白為GAPDH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)觀察

圖1為各組大鼠心肌組織病理變化觀察圖。空白組大鼠心肌纖維排列整齊，無(wú)炎性浸潤(rùn)的發(fā)生。模型組大鼠心肌細(xì)胞增大，心肌纖維排列較為紊亂，間隙腫脹、增寬，心肌纖維缺損。低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌纖維排列稍微規(guī)整，間隙腫脹現(xiàn)象消失，可見有橫縱紋，存在輕度的心肌纖維顆粒狀變性，且存在缺損、斷裂，細(xì)胞核呈現(xiàn)為圓形，但高劑量組大鼠心肌病理變化改善較為明顯。

圖1 各組大鼠病理組織學(xué)觀察圖(HE×200)

2.2 各組大鼠心肌酶水平比較

見表1。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠血清中CK、LDH、AST均高于空白組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠血清中CK、LDH、AST均低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組大鼠血清中CK、LDH、AST均低于低劑量組、中劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 各組大鼠心肌酶水平比較

2.3 各組大鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡情況、心肌細(xì)胞自噬體數(shù)量比較

見表2、圖2。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、心肌細(xì)胞自噬體數(shù)量均高于空白組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、心肌細(xì)胞自噬體數(shù)量均低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組大鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、心肌細(xì)胞自噬體數(shù)量均低于低劑量組、中劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表2 各組大鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡情況、心肌細(xì)胞自噬體數(shù)量比較

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較(TUNEL×400)

2.4 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)量比較

見表3。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌組織中Bcl-2表達(dá)量低于空白組，Bax、Caspase-3表達(dá)量高于空白組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌組織中Bcl-2表達(dá)量高于模型組，Bax、Caspase-3表達(dá)量低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組大鼠心肌組織中Bcl-2表達(dá)量高于高于低劑量組、中劑量組，Bax、Caspase-3表達(dá)量低于低劑量組、中劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表3 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)量比較

2.5 各組大鼠心肌線粒體PINK1/Parkin通路蛋白表達(dá)量比較

見表4。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌線粒體PINK1、Parkin、p62、LC3Ⅱ表達(dá)量均高于空白組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌線粒體PINK1、Parkin、p62、LC3Ⅱ表達(dá)量均低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；高劑量組大鼠心肌線粒體PINK1、Parkin、p62、LC3Ⅱ表達(dá)量均低于低劑量組、中劑量組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表4 各組大鼠心肌線粒體PINK1/Parkin通路蛋白表達(dá)量比較

3 討論

自噬是生物體生長(zhǎng)發(fā)育中起著關(guān)鍵的自救行為，當(dāng)線粒體發(fā)生自噬現(xiàn)象后可特異性識(shí)別細(xì)胞內(nèi)損傷的線粒體，并可選擇性的將其清除，線粒體自噬在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、線粒體正常形態(tài)、功能等有著重要的作用[5]。有研究表明[6-7]，當(dāng)心肌缺血再灌注發(fā)生后，在缺血階段心肌自噬水平顯著增加，而處于再灌注階段時(shí)自噬會(huì)被進(jìn)一步的激活，雖然自噬能夠?qū)p傷的細(xì)胞器、蛋白進(jìn)行選擇性的吞噬清除來(lái)對(duì)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行維持，但對(duì)于過(guò)度激活的自噬來(lái)說(shuō)，此時(shí)的自噬會(huì)對(duì)細(xì)胞器進(jìn)行過(guò)度的清除，進(jìn)而加重心肌損傷程度。

缺血再灌注會(huì)引起心肌自噬體的異常增加，進(jìn)而誘發(fā)自噬作用，將Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活引發(fā)一系列的線粒體變化，之后將凋亡誘導(dǎo)因子釋放，最終促使心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡[8-9]。Caspase家族屬于內(nèi)切蛋白家族，可對(duì)細(xì)胞凋亡、炎癥起到調(diào)控作用，Caspase-3為Caspase家族中一個(gè)較為重要的因子，可反應(yīng)出細(xì)胞凋亡情況，當(dāng)其被活化后會(huì)對(duì)核酸內(nèi)切酶、細(xì)胞骨架蛋白以及降解DNA修復(fù)酶起到激活作用，最終對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控[10-11]。Bcl-2家族參與調(diào)控細(xì)胞凋亡，包括促凋亡、抑凋亡蛋白，促凋亡、抑凋亡蛋白之間的平衡可對(duì)細(xì)胞正常的凋亡進(jìn)行維持，但當(dāng)其失衡后則會(huì)雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，Bcl-2可在一定程度上對(duì)線粒體中的促進(jìn)凋亡蛋白起到抑制作用，進(jìn)而阻止細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞色素c對(duì)Caspase家族的激活作用[12-14]。本文結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注模型大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)量與空白組相比均呈現(xiàn)為異常的表達(dá)，但使用黃芪甲苷治療的大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白異常表達(dá)狀態(tài)得到改善，但運(yùn)用高劑量的黃芪甲苷治療的大鼠上述蛋白水平改善程度更為明顯，此結(jié)果說(shuō)明，黃芪甲苷可在一定程度上改善凋亡蛋白的異常表達(dá)，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)為劑量依賴。

PINK1/Parkin通路為介導(dǎo)線粒體自噬的經(jīng)典通路之一，當(dāng)線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷后，線粒體膜電位會(huì)下降，進(jìn)而引起線粒體外膜聚集較多的PINK1蛋白，進(jìn)而對(duì)Parkin蛋白進(jìn)行激活，將位于細(xì)胞胞漿中的Parkin蛋白轉(zhuǎn)位至線粒體中，進(jìn)而將p62召集至線粒體基質(zhì)中，而當(dāng)p62被召集至線粒體基質(zhì)中后會(huì)和LC3相結(jié)合，介導(dǎo)線粒體自噬。LC3Ⅱ?qū)儆谝环N線粒體自噬特異性的信號(hào)蛋白，是由LC3Ⅰ和PE泛素樣相結(jié)合形成的，可將自噬體數(shù)量反應(yīng)出來(lái)[15-17]。當(dāng)較為嚴(yán)重線粒體損傷發(fā)生時(shí)，會(huì)導(dǎo)致線粒體無(wú)法通過(guò)自噬維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而引起自噬發(fā)生紊亂，在一定程度上對(duì)線粒體中的促凋亡的蛋白起到抑制作用，進(jìn)而阻止細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞色素c對(duì)Caspase家族的激活作用[18-19]。目前臨床上已有研究[20]證實(shí)黃芪甲苷可調(diào)節(jié)心肌缺血再灌注大鼠線粒體自噬，但其研究并未明確其作用機(jī)制，本研究黃芪甲苷通過(guò)作用于PINK1/Parkin通路蛋白，調(diào)控通路蛋白以及凋亡蛋白的異常表達(dá)，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善線粒體自噬，證實(shí)黃芪甲苷可調(diào)節(jié)心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞及線粒體自噬，進(jìn)一步明確了其作用機(jī)制，為臨床上黃芪甲苷的應(yīng)用提供支持。

綜上所述，黃芪甲苷通過(guò)作用于PINK1/Parkin通路，共同調(diào)控自噬蛋白和凋亡蛋白，進(jìn)而起到調(diào)節(jié)心肌缺血再灌注大鼠線粒體自噬，抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，且呈劑量依賴。