陳瑤，宋洋，楊仁義，楊小鈺，胡華，劉利娟，周德生*

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208)

阿爾茲海默病(Alzheimer Disease,AD)是一種以記憶和認知功能下降、行為及人格異常改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。我國伴隨老齡化加重，2012年AD患者數(shù)約為700萬，給家庭和社會帶來一定負擔。AD發(fā)病機制復雜，β淀粉樣蛋白(Amyloid protein,Aβ)沉積是AD發(fā)病的重要機制，Aβ是淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)的水解產(chǎn)物，具有神經(jīng)毒性，與細胞內(nèi)Ca2+超載、炎癥反應、神經(jīng)元凋亡發(fā)生聯(lián)系[2-3]。Aβ的大量沉積引發(fā)突觸功能障礙[4-5]，從而導致癡呆。因此APP的表達與AD發(fā)病密切相關(guān)，并涉及諸多環(huán)節(jié)。

AD屬中醫(yī)“癡呆”“善忘”等范疇。與腎、心、脾、肝功能密切，多屬本虛標實之證。老年中多以腎虛致瘀血發(fā)病，陰虛血瘀阻滯腦絡(luò)，使神靈失養(yǎng)，出現(xiàn)神經(jīng)功能癥狀，善忘、失算、齒脫、發(fā)白、腰膝酸軟、乏力、轉(zhuǎn)身遺忘、神情呆滯[6]。中醫(yī)藥充分發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)的作用，在治療AD方面優(yōu)勢顯著，活血榮絡(luò)方作為湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科協(xié)定方，臨床運用已久，療效確切。本研究以多奈哌齊和分泌型卷曲蛋白(the Secreted Frizzled related protein,sFRP)為對照，觀察不同劑量活血榮絡(luò)方對Aβ25-35損傷星形膠質(zhì)細胞的保護作用及對Aβ及APP的表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性清潔級SD大鼠120只，2～3個月，體質(zhì)量200～250 g(含藥血清240 mL)； 24 h內(nèi)的新生SD大鼠60只，體質(zhì)量5～6 g(原代膠質(zhì)細胞培養(yǎng))，隨機分配，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗藥物

活血榮絡(luò)方(成分：雞血藤:石楠藤:玄參:生地黃:黃精:乳香:沒藥:川芎=6:6:3:3:3:2:2:2比例組成)。經(jīng)過提取、濃縮、冷卻等步驟后得到浸膏，于4 ℃保存。根據(jù)人與大鼠體表面積換算法，用蒸餾水按1 mL/100 g配比稀釋浸膏，稀釋后1 mL含生藥1.1 g的藥液進行灌胃。

鹽酸多奈哌齊(陜西方舟制藥有限公司；國藥準字：H20030583；規(guī)格：5 mg/片)，粉碎后溶解于蒸餾水，配成5.8 mg/kg溶液，于4 ℃保存。

Aβ25-35(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，按照Aβ25-35說明書配制，于4 ℃保存。

1.3 主要試劑及儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBCO)，胎牛血清(Hyclone)，DAB試劑盒(北京中杉金橋)，1:250胰蛋白酶(AMRESCO)左旋多聚賴氨酸、DMSO、MTT、RNA酶A、FITC標記的羊抗兔抗體、PI(Sigma公司)，一次性細胞培養(yǎng)瓶、板(Corning公司)，倒置顯微鏡 (德國Leica)，CO2培養(yǎng)箱(德國WTB150)。

1.4 方法

1.4.1 AD靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫，以“Alzheimer Disease”為檢索詞，收集AD的作用靶點，以Score值≥15為限定條件進行篩選。采用string數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件Network analyzer功能構(gòu)建靶點PPI網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)Degree值對靶點進行篩選分析。

1.4.2 疾病靶點基因本體論(GO)富集分析

通過DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫，將疾病靶點進行GO富集分析。共同靶點以“OFFICIAL GENE SYMBOL”格式導入，設(shè)定“Background”為“Homo sapiens”，設(shè)定P<0.05，分別導出細胞組分(Cellular Component, CC)、分子功能(Molecular Function, MF)，生物過程(Biological Process, BP)，對P值取負對數(shù)，得出“-lgP”，將數(shù)據(jù)導入Origin，繪制heatmap進行富集分析。

1.4.3 含藥血清制備

SD大鼠120只隨機分成空白組、sFRP組、多奈哌齊組、0.5倍活血榮絡(luò)方組、1倍活血榮絡(luò)方組、2倍活血榮絡(luò)方組，每組20只，藥物組按體表面積換算給藥，空白組以蒸餾水灌胃，1 d/次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥1 h后，在無菌條件下經(jīng)腹主動脈采血，分離血清、滅活補體、微孔濾膜過濾除菌、-20 ℃保存。

1.4.4 星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)及Aβ25-35星形膠質(zhì)細胞AD模型制備

采用新生SD大鼠大腦皮質(zhì)提取的原代星形膠質(zhì)細胞，并進行體外培養(yǎng)與純度鑒定，經(jīng)鑒定后進行干預。采用40 μmol/L的Aβ25-35干預鑒定后的星形膠質(zhì)細胞24 h，制備Aβ25-35星形膠質(zhì)細胞(Aβ25-35AS)AD模型。

1.4.5 實驗分組與給藥

分別將Aβ25-35AS鋪板，密度為(2.5～3)×104/孔，接種于96孔板，隨機分成空白組、sFRP組、多奈哌齊組、0.5倍活血榮絡(luò)方組、1倍活血榮絡(luò)方組、2倍活血榮絡(luò)方組，采用DMEM清洗2～3次，藥物組予以含藥血清，sFRP予以sFRP，空白組予以空白血清。分別取生長對數(shù)期細胞加刺激處理12 h、24 h、48 h、72 h。

1.4.6 MTT檢測細胞活性

各組相應刺激處理12 h、24 h、48 h、72 h后，加入濃度為40 μmol/L的Aβ，24 h后各組均加入MTT 20 μL(5 mg/mL，溶于0.01 mol/L PBS)，培養(yǎng)4 h后吸取上清液，加入DMSO100 μL并振蕩10 min，然后在檢測波長570 nm的TECAN多功能酶標儀條件下測各孔吸光度(OD值)。

1.4.7 Aβ及APP表達的檢測

取細胞上清液并分離細胞，采用免疫組化法檢測各組Aβ、APP蛋白的定位定量表達。按照免疫組化試劑盒進行染色，每組選取6 張切片，并隨機觀察5個視野，選取視野內(nèi)所有陽性細胞，根據(jù)陽性細胞面積/總面積計算面密度，以評估Aβ、APP蛋白的定量表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 疾病靶點預測以及構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖

通過GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫，以“AD”為檢索詞，收集AD作用靶點，以Score值≥15為限定條件進行篩選，得到35個靶點；采用string數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件Network analyzer功能構(gòu)建靶點PPI網(wǎng)絡(luò)(圖1)。按照“Degree”分析，顏色越深，Combine score值越大，其中APOE、APP最為顯著，結(jié)果表明可能通過多個作用靶點致AD。因此這些靶點為治療提供新思路。為我們運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法對活血榮絡(luò)方治療AD進一步探索提供前期研究基礎(chǔ)。

圖1 AD靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.2 疾病靶點GO富集分析

利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫，將35個靶點進行GO富集分析，對P值取負對數(shù)，得出“-lgP”值，-lgP值越大，富集程度越大，各取BP、CC、MF前15個Gene ID，通過基因靶點PPI網(wǎng)絡(luò)建立，取具有相對較強作用聯(lián)系的15個靶點APOE、APP、PSEN1、PSEN2、SNCA、ACHE、TNF、BDNF、MAPT、NGF、ADAM10、MAOB、CASP3、STAT3、GSK3B進行分析。運用Origin軟件將“-lgP”值值作為依據(jù)對每個基因進行賦值，繪制heatmap，得到圖2。GO富集結(jié)果顯示說明APOE、APP、PSEN1、PSEN2、SNCA在多部位、通過多途徑調(diào)控AD的發(fā)生發(fā)展，有望成為重要治療靶點，為治療AD提供新的理論依據(jù)。

注：橫坐標為GO(MF; CC;BP)；縱坐標為共同靶點圖2 GO富集分析

2.3 MTT檢測各組對Aβ25-35AS的作用

MTT結(jié)果各組12 h、24 h、48 h、72 hOD值顯示，隨著時間延長OD值越大，2倍活血榮絡(luò)方組72 h高于12 h，且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各組OD值隨時間增加，但無明顯差異(P>0.05)。各組OD值比較結(jié)果：藥物組OD值均高于空白組，即AS細胞活性均高于空白組(P<0.05)；2倍活血榮絡(luò)方組具有最高的細胞活性，sFRP組具有最低細胞活性(P<0.05)，且具有統(tǒng)計學意義。OD值詳見圖3。

圖3 各組對Aβ25-35AS模型OD值的影響

2.4 各組Aβ25-35損傷星形膠質(zhì)細胞Aβ及APP表達比較

Aβ及APP主要表達在細胞漿上，免疫組化染色呈棕黃色，各給藥組Aβ及APP的表達均低于空白組(P<0.05)。2倍活血榮絡(luò)方組Aβ及APP表達均低于其它給藥組(P<0.01)。1倍活血榮絡(luò)方組與多奈哌齊組Aβ及APP表達下降程度差異比較P>0.05。并且，各組Aβ及APP表達隨時間延長有逐漸減少趨勢，但2倍活血榮絡(luò)方組減少最明顯。見圖4、表1。

表1 各組Aβ25-35損傷星形膠質(zhì)細胞Aβ及APP的表達

圖4 各組各時間點Aβ及APP的表達

3 討論

AD屬中醫(yī)“癡呆”“善忘”等范疇，病性總屬本虛標實，病位在腦，與腎、心、脾、肝等密切相關(guān)。腎主藏精，精充髓海，髓以養(yǎng)榮，則腦功能正常，AD者腎精不足，髓海虧虛也?！八韬２蛔?，則腦轉(zhuǎn)耳鳴，脛酸眩冒，目無所見，懈怠安臥”(《靈樞·海論》)?！鞍V呆者，因陽氣衰，則心力漸退、忘失前后、興居怠惰”(《千金翼方》)，此中多指腎陽衰弱，則發(fā)為癡呆，且記憶力下降。榮氣者，氣、血、津、液、精等精微物質(zhì)總稱也，榮氣源于先天之精，賴水谷精微和自然清氣充養(yǎng)，化生于五臟，以榮養(yǎng)溫潤全外顯之象源于精氣之榮華。髓不生，則榮氣異常，引起榮氣虛滯。榮氣虛滯又無力充養(yǎng)腦脈，填補腎精，繼而神經(jīng)癥狀日益嚴重，人至四十者多“陰氣自半，腎陰不足，起居衰而多忘”(《素問·陰陽應象大論》)，仲景提出“喜忘者必有蓄血”的理論 (《傷寒論·辨陽明病脈證并治》)，王清任進一步闡述“瘀血者，令人善忘”(《醫(yī)林改錯》)，綜上,腎陰不足則多健忘，多瘀血，可知陰虛血瘀是癡呆發(fā)病的關(guān)鍵病機，故生命盛極而衰乃生命之道，而榮氣之虛與榮氣之滯為其推動原因。榮氣虛滯彼此消長平衡，無修復契機者，虛更虛，滯更滯，進而加速AD進程[7-8]?；凇瓣幪撗觥獦s氣虛滯”理論立方的活血榮絡(luò)方具有滋陰生津、活血通絡(luò)的功效，在AD臨床治療中取得療效較好。

AD是老年人的常見病，多發(fā)病，近年研究表明β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)是AD至關(guān)重要的致病因素[9]，AD主要病理變化是來源于β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)的沉積在胞外沉積形成老年斑。APP作為一種跨膜蛋白，能被APP切割酶、β-分泌酶、γ-分泌酶(presenilin-1,PSEN1)切割形成Aβ，APP/Aβ穩(wěn)態(tài)失衡能使自噬體中Aβ沉積[10]，是各種原因誘發(fā)AD的共同通道，可導致神經(jīng)元退化和死亡。大量流行病學、病理學、免疫學、生物化學和分子生物學研究表明AD患者腦內(nèi)持續(xù)存在著激活的神經(jīng)膠質(zhì)細胞與慢性炎癥反應，可能是其它病理特征形成和發(fā)展的誘發(fā)因素。因此有學者認為AD可能是一種慢性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應[11]，其炎癥主要是由于Aβ介導的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞活化所觸發(fā)[12-13]，Aβ能誘導炎性細胞因子(如IL-1β、TNF-α、IL-6、血管內(nèi)皮粘附分子等)在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞中表達[14]，越來越多的證據(jù)表明Aβ可通過Toll樣受體、糖基化終末產(chǎn)物受體、轉(zhuǎn)化生長因子β1和NOD樣受體等激活神經(jīng)膠質(zhì)細胞，激活的神經(jīng)膠質(zhì)細胞能分泌出毒性細胞因子和化學因子，從而增加APP產(chǎn)生、促進Aβ裂解、聚集并沉積形成老年斑。炎癥因子能介導局部炎癥反應，導致腦內(nèi)炎性產(chǎn)物水平持續(xù)升高，對神經(jīng)突觸等結(jié)構(gòu)產(chǎn)生毒副作用，進而導致突觸傳遞功能障礙等病理損害的發(fā)生。水平異常升高的炎性產(chǎn)物在AD病理損傷的不同階段具有不同的作用，并貫穿于AD發(fā)生和發(fā)展的整個過程。Aβ導致的局部炎癥反應在AD的形成和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。

本研究結(jié)合生物信息學，運用中醫(yī)藥多途徑、多靶點、雙向調(diào)節(jié)的優(yōu)勢，基于GeneCards數(shù)據(jù)庫，篩選AD共35個靶點，結(jié)合String及Cytoscape軟件算法分析對35個功能靶點進行蛋白互作PPI分析，其中APOE、APP最為顯著，見圖5,前期研究結(jié)果[15-16]證實活血榮絡(luò)方能上調(diào)Wnt5α、Fz5、Ca MKII、AchE、ChAT等靶點水平,在AD治療中發(fā)揮作用。從微觀角度推測活血榮絡(luò)方可能通過調(diào)節(jié)APP的表達在治療AD中發(fā)揮作用。同時利用DAVID數(shù)據(jù)庫，將35個靶點進行GO富集分析，GO富集結(jié)果顯示說明APOE、APP、PSEN1、PSEN2、SNCA在多部位、通過多途徑調(diào)控AD的發(fā)生發(fā)展，其有望成為重要治療靶點，為治療AD提供新的理論依據(jù)。

為進一步驗證生物信息學預測結(jié)果，本研究采用Aβ25-35損傷星形膠質(zhì)細胞模型，利用MTT及免疫組化法進行驗證。MTT結(jié)果得出2倍活血榮絡(luò)方組72 h星形膠質(zhì)細胞活性高于各組，免疫組化結(jié)果得出2倍活血榮絡(luò)方組Aβ及APP表達均低于其它給藥組，并且Aβ及APP表達隨時間延長有逐漸減少趨勢，但2倍活血榮絡(luò)方組減少最明顯，表明活血榮絡(luò)方具有較強的劑量與時間依賴性，且呈正相關(guān)，得出活血榮絡(luò)方可通過調(diào)控APP及Aβ蛋白表達從而抑制Aβ25-35誘導的星形膠質(zhì)細胞損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護作用，并且高劑量、時間越長，作用越強。Aβ能誘導星形膠質(zhì)細胞中炎性細胞因子表達[14]，炎癥因子介導的慢性炎癥反應可導致腦內(nèi)炎性產(chǎn)物水平持續(xù)升高，對突觸產(chǎn)生毒性作用，導致突觸傳遞功能障礙等病理損害的發(fā)生，本研究采用中樞性乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑多奈哌齊與Wnt通路抑制劑sFRP作為對照組，結(jié)果顯示活血榮絡(luò)方可能通過Wnt信號通路抑制 AChE活性，改善神經(jīng)突觸炎癥毒性，進而在AD疾病治療中發(fā)揮作用。

圖5 共同靶點富集hsa05010通路情況

綜上所述，本研究為AD的臨床治療提供了理論和實驗依據(jù)，提出基于“陰虛血瘀—榮氣虛滯”理論立方的活血榮絡(luò)方可能通過多靶點、多成分、多通路發(fā)揮治療AD疾病的作用，并進一步實驗驗證其治療作用可能通過Wnt信號通路抑制APP、Aβ蛋白的表達，抑制 AChE活性，從而改善神經(jīng)突觸炎癥毒性有關(guān)。