王曉莉,李哲,葉文武,楊紅福,莊義慶,鄭小波*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212400)

水稻惡苗病是水稻上的重要病害,自1828年在日本首次報道以來,幾乎在世界各水稻種植區(qū)均有發(fā)生,是影響水稻生產(chǎn)的重要病害之一[1]。水稻惡苗病在我國分布較廣泛,在各稻區(qū)均造成不同程度危害[2-5]。水稻惡苗病一般會造成減產(chǎn)10%～20%,嚴(yán)重時減產(chǎn)50%以上[6]。水稻惡苗病的病原菌有藤倉鐮孢(Fusariumfujikuroi)、層出鐮孢(F.proliferatum)、擬輪枝鐮孢(F.verticilliodes)和F.andiyazi,其中藤倉鐮孢致病力最強(qiáng),分布最廣,是引起水稻惡苗病的主要致病菌。水稻惡苗病在水稻苗期的癥狀有徒長、葉片細(xì)長呈淡綠色、矮化、死苗等,在成株期引起根部和莖基部腐爛,嚴(yán)重時整株枯死[7]。

帶菌種子是惡苗病的主要初始菌源,不僅影響種子的質(zhì)量和萌發(fā)率,帶菌稻種播種后,還會引起秧苗發(fā)病。惡苗病菌在病苗上產(chǎn)生分生孢子,分生孢子隨風(fēng)雨傳播,侵染健康植株使其發(fā)病,引起再侵染[8-9]。因此做好種子帶菌檢測,對指導(dǎo)該病防治有重要意義。傳統(tǒng)的種子帶菌常用檢測方法有:水瓊脂平皿法、吸水紙保濕法、水洗法和分離培養(yǎng)法。這些檢測方法耗時長,對所獲得分離物需要依據(jù)形態(tài)和生物學(xué)特征進(jìn)行鑒定,對相近種極易造成鑒定失誤[10-11]。一些常規(guī)的分子檢測技術(shù),如普通PCR、實時熒光定量PCR等,極大地提高了種子帶菌檢測的效率和準(zhǔn)確性,但這些技術(shù)仍存在某些不足,如所需反應(yīng)時間長、對DNA模板質(zhì)量要求高、需要昂貴的儀器等,不能滿足基層檢測的需求[12-13]。自21世紀(jì)初建立并發(fā)展起來的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時間短、結(jié)果可肉眼判別、對模板質(zhì)量要求低和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[14-15]。

目前對當(dāng)前江蘇省水稻種子攜帶惡苗病菌的狀況及其病原菌種類組成仍知之甚少。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)卵菌與真菌分子生物學(xué)實驗室(以下簡稱本實驗室)曾對從江蘇省收集的65份稻種攜帶惡苗病菌情況進(jìn)行過檢測[16],但由于所檢測稻種樣本數(shù)量偏小,種子來源地偏少,且種子的生產(chǎn)年份不詳,仍不足以準(zhǔn)確反映江蘇省稻區(qū)當(dāng)前水稻種子攜帶惡苗病菌的狀況。本研究應(yīng)用本實驗室建立的能夠特異性檢測藤倉鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢、F.andiyazi的4個LAMP技術(shù)體系和可快速檢測水稻種子攜帶惡苗病菌的LAMP檢測方法,對江蘇省13個地區(qū)2017年收獲的103份水稻種子攜帶的惡苗病菌進(jìn)行檢測,旨在了解江蘇當(dāng)前水稻栽培品種種子攜帶惡苗病菌的狀況及所攜帶病原菌的種類組成,研究結(jié)果將為該病的防治提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 供試品種

2018年3至5月收集江蘇省2017年收獲的103份水稻種子,品種和來源地見表1。收集的稻種用牛皮紙袋分裝,并用密封袋封口保存,編號記錄品種和種子產(chǎn)地信息。

1.2 供試水稻種子攜帶惡苗病菌的DNA提取

采用本實驗室建立的水洗法[16]。將供試稻種混勻后,每份稱取50 g放入250 mL的三角瓶中,加入200 mL ddH2O,滴加20%吐溫3～5滴。錫箔紙封口,放入超聲波清洗器內(nèi),以40 kHz的頻率振蕩洗滌 10 min。將洗滌液用75 μm孔徑的鋼篩過濾至干凈的空瓶中,并用少量的ddH2O沖洗稻種。濾液經(jīng) 6 500 r·min-1離心5 min,棄上清液,保留沉淀。將沉淀物放置在37 ℃的烘箱中烘干。沉淀物DNA提取采用美國MOBIO公司的微生物DNA提取試劑盒(PowerSoil?DNA Isolation Kit),方法步驟參照說明書。

1.3 水稻種子攜帶惡苗病菌的LAMP檢測

采用本實驗室建立的可分別特異性識別藤倉鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢和F.andiyazi的LAMP檢測技術(shù)[17-19],以1.2節(jié)提取的基因組DNA為模板進(jìn)行檢測。

LAMP反應(yīng)的總體積為26 μL,其中:10×ThermoPol Buffer[0.1% Trion-X,20 mmol·L-1Tris-HCl,10 mmol·L-1KCl,10 mmol·L-1(NH4)2SO4,pH8.8]2.5 μL,MgSO4(50 mmol·L-1)4 μL,甜菜堿(5 mol·L-1)4 μL,dNTPs(10 mmol·L-1)3.5 μL,內(nèi)引物FIP和BIP(20 μmol·L-1)各2 μL,外引物F3和B3(10 μmol·L-1)各0.5 μL,環(huán)引物L(fēng)F和LB(10 μmol·L-1)各1 μL,HNB(2.4 mmol·L-1)2 μL,Bst DNA 聚合酶(8 U·μL-1)1 μL,模板DNA 2 μL(從水稻種子樣本提取)。反應(yīng)結(jié)束后肉眼觀察指示劑顏色變化來判斷檢測結(jié)果,陰性呈紫色,陽性呈天藍(lán)色。陰性對照以ddH2O替代DNA模板,陽性對照以病原菌純培養(yǎng)的DNA作為模板。試驗重復(fù)3次。

4種水稻惡苗病菌的LAMP反應(yīng)條件和靈敏度:藤倉鐮孢、層出鐮孢和擬輪枝鐮孢的反應(yīng)條件為 62 ℃ 70 min,檢測靈敏度分別為100、400和100 pg·μL-1;F.andiyazi的反應(yīng)條件為64 ℃ 80 min,靈敏度為100 pg·μL-1。

1.4 LAMP檢測稻種帶菌結(jié)果的驗證

為驗證LAMP檢測水稻種子上攜帶惡苗病菌的結(jié)果,選擇藤倉鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢和F.andiyazi呈陽性的樣本播種。將稻種混勻后,每個品種稱取10 g置于培養(yǎng)皿中,常溫下用ddH2O浸泡18 h,隨后將種子轉(zhuǎn)移至28 ℃恒溫培養(yǎng)箱直到稻種露白。將露白的稻種播種在直徑為10 cm的塑料盆中,每盆播種30～40粒,放置在28 ℃、12 h光暗交替的溫室中培育14 d。選取疑似水稻惡苗病(徒長、褪綠、矮化和死苗)的稻苗10株,剪取根莖部0.5 cm大小的組織,混勻后分為2份。一份用來提取DNA進(jìn)行LAMP檢測,另一份用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇消毒30 s,再用2%次氯酸鈉消毒2.5 min,無菌水沖洗 3次。將表面消毒的病組織置于PDA培養(yǎng)基平板上,在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)48 h,從菌落邊緣切取2 mm×2 mm 菌絲塊移至新的PDA培養(yǎng)基上純化,獲得純培養(yǎng)分離物。秧苗病組織和病原菌分離物基因組DNA提取方法采用天根生化科技(北京)有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒。病原菌分離物依據(jù)其形態(tài)和TEF-1α序列比對進(jìn)行種的鑒定。試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 江蘇省水稻種子攜帶水稻惡苗病菌的LAMP檢測結(jié)果

應(yīng)用可分別特異性識別4種水稻惡苗病菌的LAMP檢測技術(shù),用水洗法[16]提取水稻種子上攜帶病菌的基因組DNA為模板,對江蘇省13個地區(qū)2017年收獲的103份水稻種子上攜帶的惡苗病菌進(jìn)行檢測。以品種‘鹽粳15’種子帶菌檢測結(jié)果為例(圖1),反應(yīng)結(jié)果呈紫色為陰性,藍(lán)色為陽性,通過肉眼觀察可直接判定‘鹽粳15’供試稻種上同時攜帶藤倉鐮孢、層出鐮孢和擬輪枝鐮孢3種病原菌。

供試103個水稻品種的種子樣本中,有89個品種攜帶水稻惡苗病菌(表1),帶菌率占總樣本的 86.4%,表明當(dāng)前江蘇省稻種攜帶惡苗病菌十分普遍。在供試稻種樣本中,4種惡苗病菌均被檢測到,但不同惡苗病菌出現(xiàn)頻率有差異。其中,檢出率最高的病原菌是藤倉鐮孢,有86份樣本攜帶該菌,其次是層出鐮孢16份,擬輪枝鐮孢和F.andiyazi各有2份,檢出率依次為83.5%、15.5%、1.9%和1.9%。

表1 江蘇省2017年水稻種子攜帶惡苗病菌的LAMP檢測結(jié)果

103份種子攜帶惡苗病的狀況大致包括以下4種類型:1)僅攜帶1種病原菌。僅攜帶藤倉鐮孢的品種有73份,占所檢測總樣本的70.9%;僅攜帶層出鐮孢的品種有3份,占所檢測總樣本的2.9%。2)攜帶 2種病原菌。同時攜帶藤倉鐮孢和層出鐮孢的有11份;攜帶藤倉鐮孢和F.andiyazi有1份(無錫的‘武運(yùn)粳31’)。3)攜帶3種病原菌。同時攜帶藤倉鐮孢、層出鐮孢和擬輪枝鐮孢的有1份(‘鹽粳15’)。4)攜帶4種水稻惡苗病菌有1份(鎮(zhèn)江的‘鎮(zhèn)稻21’)。

從檢測結(jié)果可以看出,有部分稻種可同時攜帶不止一種惡苗病菌,在供試的103份稻種中,有14份攜帶2種或2種以上水稻惡苗病菌,占總樣本數(shù)的13.6%。此外,有14份稻種未檢測到攜帶惡苗病菌。

2.2 LAMP檢測稻種上攜帶水稻惡苗病菌的分離結(jié)果

為驗證LAMP檢測水稻種子帶菌結(jié)果的準(zhǔn)確性,我們選取6個品種進(jìn)行播種育苗,包括:1)不攜帶惡苗病菌的‘華粳8號’作為對照;2)只攜帶藤倉鐮孢的‘鎮(zhèn)稻14號’、僅攜帶層出鐮孢的‘連粳12’和‘徐稻8’;3)同時攜帶藤倉鐮孢和層出鐮孢的‘鎮(zhèn)稻99’;4)4種病原菌都攜帶的‘鎮(zhèn)稻21’。從表2可以看出:除‘鎮(zhèn)稻21’外,其余5個品種發(fā)病秧苗的LAMP檢測結(jié)果和病原菌分離結(jié)果及種子帶菌的檢測結(jié)果一致。而‘鎮(zhèn)稻21’發(fā)病秧苗病組織的LAMP檢測和病原菌分離結(jié)果有差異,LAMP檢測出除擬輪枝鐮孢外的其他3種病原菌,但從病組織中只分離出藤倉鐮孢和層出鐮孢2種惡苗病菌?！?zhèn)稻21’種子攜帶的擬輪枝鐮孢在發(fā)病秧苗中未能檢測到,可能與種子帶菌量低從而不足以致病有關(guān)。已有研究報道稻種上鮮有攜帶擬輪枝鐮孢,種子帶菌可能不是該菌所致惡苗病的主要初侵染源[16]。F.andiyazi雖然在秧苗病組織中被檢測到但未能分離出來,主要原因可能是該病原菌致病力較弱,在病組織中未能競爭過優(yōu)勢病菌。由于LAMP檢測靈敏度顯著高于組織分離法,此外還有諸多因素如病菌致病力強(qiáng)弱和競爭力、病組織質(zhì)量的好壞等均可能影響到分離結(jié)果。此外,經(jīng)LAMP檢測種子未攜帶惡苗病菌的‘華粳 8號’,其種子所育秧苗的LAMP檢測和組織分離均未檢出惡苗病菌。上述結(jié)果表明,本研究種子帶菌的LAMP檢測結(jié)果是可靠的。

表2 水稻秧苗的LAMP檢測與病原菌分離結(jié)果

表2結(jié)果還顯示,僅攜帶層出鐮孢的‘連粳12’和‘徐稻8’稻種所育發(fā)病秧苗,對層出鐮孢特異的LAMP檢測呈陽性,并從發(fā)病秧苗病組織中分離出層出鐮孢,說明種子上攜帶的層出鐮孢可以單獨(dú)引起水稻惡苗病,提示種子帶菌是層出鐮孢所致惡苗病的重要初侵染源。

3 結(jié)論與討論

本研究采用可分別特異性識別藤倉鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢和F.andiyazi4種惡苗病菌的LAMP檢測技術(shù),對來自江蘇省13個地區(qū)2017年生產(chǎn)的103份水稻種子攜帶的水稻惡苗病菌進(jìn)行檢測,共檢測出89份稻種樣本攜帶水稻惡苗病菌,水稻惡苗病已知的4種病原菌均被檢測到。其中,檢出率最高的是藤倉鐮孢,在所測13個地區(qū)均有檢出;其次是層出鐮孢,在8個地區(qū)有檢出;而擬輪枝鐮孢和F.andiyazi種子帶菌率低。研究結(jié)果表明,當(dāng)前江蘇省水稻栽培品種種子攜帶惡苗病菌十分普遍,藤倉鐮孢是江蘇稻種攜帶惡苗病菌的優(yōu)勢種,其次是層出鐮孢。而對于擬輪枝鐮孢和F.andiyazi,種子帶菌可能不是其所致惡苗病菌的主要初侵染源。提示,今后對江蘇稻種的種子處理劑研發(fā)應(yīng)主要針對藤倉鐮孢和層出鐮孢。

本研究共檢測到14個水稻品種不攜帶惡苗病菌,但以往的研究并未發(fā)現(xiàn)對水稻惡苗病表現(xiàn)完全抗病的品種[20]。本研究從泰州收集的‘武運(yùn)粳24’稻種上未檢測到惡苗病菌,但已有的報道均指出‘武運(yùn)粳24’為惡苗病感病品種,在揚(yáng)州、如東、靖江和南通等地發(fā)病都比較重,病株率可達(dá)30%[21-22]。本研究對其中8個品種采用分生孢子液浸種方法[19]接種藤倉鐮孢,供試8個品種的秧苗均不同程度發(fā)病(結(jié)果未顯示),由此推測上述品種的稻種未檢出惡苗病菌,可能主要與種子產(chǎn)地的局部環(huán)境及穗期氣候條件有關(guān)。

從稻種上獲取所攜帶病原菌的方法主要有:水瓊脂平皿法、吸水紙保濕法、研磨法和水洗法。瓊脂平皿法和吸水紙保濕法適于對種子帶菌部位進(jìn)行檢測,分離與鑒定病原菌所需的時間較長,通常需要10～15 d才能完成[11]。研磨法適于對稻種內(nèi)部病原菌的檢測,但稻種質(zhì)地堅硬,研磨耗時耗力,難以滿足大批量種子樣本的檢測。水洗法適于種子表面的帶菌檢測,方法簡單易行,便于對大批量樣本進(jìn)行檢測。本實驗室建立的改良水洗法在種子水洗過程中加入超聲波處理,可顯著提高從種子上提取所攜帶病原菌的效率,從獲得的沉淀物中提取的基因組DNA可以用作LAMP檢測模板[16]。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)對DNA模板質(zhì)量的要求極低,可從混雜有稻種組織、病原菌以及其他各種微生物的基因組DNA中檢測出目標(biāo)病原菌,同時還具有檢測所需時間短(完成一次種子帶菌檢測僅需4 h左右)、病原菌的檢測與種的鑒定同步完成、反應(yīng)結(jié)果可用肉眼直觀判定等優(yōu)點(diǎn),顯著提高檢測效率。

袁詠天等[16]在研發(fā)水稻種子攜帶惡苗病菌的LAMP檢測方法過程中,曾收集部分江蘇水稻種子樣本用于該檢測方法的可靠性驗證。該研究所檢測稻種的樣本數(shù)偏小,種子來源地僅包含江蘇8個地區(qū),缺少來自蘇南蘇州和無錫以及蘇東南通的種子樣本,且供測稻種主要購自種子公司門市部,故而種子生產(chǎn)年份不詳。相比較之下,本研究結(jié)果更能準(zhǔn)確反映當(dāng)前江蘇水稻栽培品種種子攜帶惡苗病菌的狀況及其病原菌種類組成,研究結(jié)果對指導(dǎo)江蘇水稻惡苗病的防治更具實際價值。本研究從來自江蘇鎮(zhèn)江和南通的2份種子上首次檢出攜帶擬輪枝鐮孢,但在所育秧苗的LAMP檢測和組織分離物中均未檢出該病原菌。有報道指出,由擬輪枝鐮孢引起的惡苗病在江蘇的南京和鎮(zhèn)江大田成株期具有一定的發(fā)病率[18],提示由該病原菌所致惡苗病的初侵染源可能來自稻田。