吳 桐，黨寬榮，蘇靜波，呂葆真，陸新婷，惠延年，杜紅俊

0引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, ARMD)是老年人不可逆盲的最主要原因。按照病理變化不同，ARMD可以分為干性和濕性?xún)煞N類(lèi)型。干性ARMD的主要病理改變之一是視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)細(xì)胞的凋亡和由此導(dǎo)致的感光細(xì)胞死亡，而氧化應(yīng)激損傷是主要原因[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡機(jī)制，它通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)促存活和促凋亡途徑相關(guān)基因的表達(dá)，維持細(xì)胞內(nèi)代謝平衡，以及PERK-eLF2-ATF4-CHOP、IRE1-XBP1和ATF6三種經(jīng)典的信號(hào)途徑發(fā)揮作用[2]。既往研究中已證實(shí)氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, OxLDL)可引起RPE細(xì)胞凋亡，但其參與凋亡的具體機(jī)制以及ERS是否參與其中尚不明確[3-4]。本研究采用不同濃度的OxLDL作用于人RPE細(xì)胞，觀察對(duì)細(xì)胞活力和凋亡的影響，同時(shí)觀察ERS相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)酶的變化，探討ERS在OxLDL誘發(fā)的人RPE細(xì)胞凋亡中的作用和機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料人RPE細(xì)胞系A(chǔ)RPE19(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))、胎牛血清(Hyclone，澳大利亞)、低糖DMEM(Corning，美國(guó))、胰酶(Gibco，美國(guó))、青霉素/鏈霉素(Gibco，美國(guó))、OxLDL、LDL、Dil-OxLDL(翊圣生物，中國(guó))、Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(碧云天，中國(guó))、CCK8(七海生物，中國(guó))、BCA蛋白定量試劑盒、小鼠源Caspase-12抗體、小鼠源β-actin抗體(CST，美國(guó))、兔源CHOP抗體、兔源GRP78抗體、兔源XBP-1抗體、兔源ATF6抗體(Proteintech，中國(guó))、兔源RPE65抗體(Abcam，美國(guó))、Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(翊圣生物，中國(guó))、DAPI(Invitrogen，美國(guó))、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天，中國(guó))、ECL超敏發(fā)光底物(四正柏，中國(guó))。主要儀器設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器)、倒置顯微鏡(Olympus，日本)、FSX100熒光顯微鏡(Olympus，日本)、SDS-PAGE 電泳儀、電泳槽及化學(xué)發(fā)光儀(Bio-Rad，美國(guó))、流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson,美國(guó))。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)ARPE19采用低糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100mg/L鏈霉素)在37°C、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RPE細(xì)胞吞噬檢測(cè)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE19接種于24孔板細(xì)胞爬片，常規(guī)培養(yǎng)至50%融合狀態(tài)后，加入25μg/mL紅色熒光探針Dil標(biāo)記的OxLDL(Dil-OxLDL)培養(yǎng)8h，4%PFA固定后免疫熒光染色，加入RPE65抗體4℃過(guò)夜，洗滌后與Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2h，DAPI染色并封片。使用激光共聚焦顯微鏡觀察RPE細(xì)胞吞噬Dil-OxLDL情況并拍照。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組和細(xì)胞活力測(cè)定將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE19接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)分為(1)對(duì)照組：完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；(2)OxLDL組：完全培養(yǎng)基中加入不同濃度 (5、10、25、50、100μg/mL)OxLDL；(3)LDL組：完全培養(yǎng)基中加入不同濃度(5、10、25、50、100μg/mL)LDL。根據(jù)我組前期實(shí)驗(yàn)方法[5]，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞，采用CCK8法評(píng)價(jià)OxLDL對(duì)細(xì)胞活力的影響。各組細(xì)胞活力以其吸光度(optical density, OD)值占正常對(duì)照組OD值的百分比表示，公式為：細(xì)胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%;As:實(shí)驗(yàn)孔吸光度(含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK8溶液和OxLDL/LDL)；Ac:對(duì)照孔吸光度(含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK8溶液，不含藥物)；Ab:空白孔吸光度(含培養(yǎng)基、CCK8溶液，不含細(xì)胞、藥物)。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]，采用25μg/mL的OxLDL處理人RPE細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞重懸于500μL上樣緩沖液，與Annexin V-FITC 和PI各5μL室溫避光孵育15min，然后采用流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson, 美國(guó))分析測(cè)定細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞總細(xì)胞凋亡率(%)=早期凋亡率(Annexin V+/PI-)+晚期凋亡率(Annexin V+/PI+)。

圖1 RPE細(xì)胞吞噬Dil-OxLDL 細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果(×200) Merge圖像為共定位；藍(lán)色為DAPI染細(xì)胞核；綠色熒光為RPE65；紅色熒光為吞噬的Dil-OxLDL。

1.2.5 Western blotting分析根據(jù)CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果所選濃度，將細(xì)胞分為對(duì)照組、OxLDL組(25μg/mL)、LDL組(25μg/mL)。按照本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的方法[8]提取蛋白，等量的各組總蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)封閉、洗滌后加入一抗小鼠源Caspase-12抗體(1∶1000)、兔源CHOP抗體(1∶1000)、兔源GRP78抗體(1∶1000)、兔源XBP-1抗體(1∶1000)、兔源ATF6抗體(1∶1000)、小鼠源β-actin抗體(1∶1000)，4°C過(guò)夜，β-actin作為內(nèi)參。洗膜后與HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2h?？乖?抗體復(fù)合物以ECL發(fā)光底物顯示，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司，Bio-Rad ChemiDoc XRS+型)采集圖像，用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以靶蛋白灰度值/β-actin灰度值的比值反應(yīng)靶蛋白相對(duì)水平。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多個(gè)樣本均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn)以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 RPE細(xì)胞吞噬OxLDL情況激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，細(xì)胞RPE65染色陽(yáng)性，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量吞噬的Dil-OxLDL，證明OxLDL可被RPE吞噬而進(jìn)入細(xì)胞，發(fā)揮進(jìn)一步作用，見(jiàn)圖1。

2.2 CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果對(duì)照組細(xì)胞活力為(100±5.637)%，與對(duì)照組比較，OxLDL組經(jīng)5、10、25、50和100μg/mL處理24h后細(xì)胞活力分別為(105.298±9.395)%、(97.106±5.417)%、(77.015±4.055)%、(67.613±3.853)%和(43.872±9.532)%，各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.45,P<0.05)，與對(duì)照組相比，25、50和100μg/mL OxLDL組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，即OxLDL在低濃度(<25μg/mL)時(shí)不影響細(xì)胞活力，而高濃度時(shí)(>25μg/mL)則可降低細(xì)胞的活力(P<0.05)。而5、10、25、50和100μg/mL LDL處理24h對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組細(xì)胞活力分別為(97.55±6.217)%、(99.640±3.586)%、(90.495±2.786)%、(83.552±9.171)%和(90.910±1.429)%，見(jiàn)圖2。

2.3 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況因濃度大于25μg/mL的OxLDL會(huì)降低細(xì)胞活力，因此我們采用25μg/mL處理RPE細(xì)胞， Annexin V-FITC/PI染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，結(jié)果顯示：對(duì)照組、OxLDL組和LDL組凋亡率分別是(5.271±0.519)%、(41.23±1.686)%和(13.07±2.579)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=329.8，P<0.01)。且OxLDL組相比LDL組和對(duì)照組，以及LDL組相比對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，見(jiàn)圖3。

圖2 CCK8檢測(cè)各組細(xì)胞活力。

2.4 Western blotting檢測(cè)ERS相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果對(duì)照組、OxLDL組、LDL組5種ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。OxLDL組ERS相關(guān)蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組和LDL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1，圖4。

3討論

ARMD是視網(wǎng)膜黃斑區(qū)的一種慢性退行性病變，在臨床上主要分為干性(萎縮型)和濕性(滲出或出血型)兩種。其中干性ARMD占確診病例的80%以上，其主要特征是早期玻璃膜疣(drusen)的形成、RPE細(xì)胞的變性死亡和由此引起的視網(wǎng)膜外屏障破壞、感光細(xì)胞的死亡，進(jìn)而造成嚴(yán)重的視力損傷。而在此過(guò)程中，年齡引起的黃斑部的氧化應(yīng)激起著重要作用[9-11]。隨著RPE細(xì)胞的衰老和感光細(xì)胞的更新，RPE細(xì)胞消化OxLDL的能力降低，過(guò)多的OxLDL在RPE細(xì)胞內(nèi)堆積，細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)和非自由基物質(zhì)增加，最終導(dǎo)致了RPE細(xì)胞的死亡[12-13]。臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明服用抗氧化劑可以減小ARMD進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)，這也證明了氧化應(yīng)激在ARMD發(fā)病中的關(guān)鍵作用[14-15]。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡方式的一種程序性，通常和早期疾病的發(fā)生密切相關(guān)。經(jīng)典的細(xì)胞凋亡通路包括：死亡受體活化(外源性)途徑即細(xì)胞表面死亡受體接受胞外死亡信號(hào)而激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡；線粒體損傷(內(nèi)源性)途徑即線粒體通過(guò)釋放凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)等激活Caspase通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而ERS引起的凋亡是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡方式。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是膜相關(guān)蛋白和分泌蛋白折疊和組裝的主要細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙可導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊能力落后于蛋白質(zhì)折疊負(fù)荷。大量錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)帶來(lái)壓力，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16-17]。ERS主要有PERK-eLF2-ATF4-CHOP、IRE1-XBP1和ATF6三種經(jīng)典的信號(hào)途徑參與，其中后兩個(gè)途徑主要調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白，例如GRP78，從而增加了蛋白質(zhì)折疊的能力[18]。雖然PERK的早期激活增加了eIF2α的磷酸化，降低了蛋白質(zhì)翻譯速率，從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從壓力中恢復(fù)。但持續(xù)的ERS會(huì)激活PERK通路的下游因子CHOP，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和死亡[19-20]。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率 A：細(xì)胞凋亡流式圖；B：細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)圖；aP<0.05 vs 對(duì)照組；cP<0.05 vs LDL組。

圖4 Western blotting檢測(cè)ERS相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果 A:各組細(xì)胞中CHOP、GRP78和Caspase-12蛋白表達(dá)結(jié)果;B:各組細(xì)胞中XBP-1蛋白表達(dá)結(jié)果;C:各組細(xì)胞中ATF6蛋白表達(dá)結(jié)果。

表1 各組中CHOP、GRP78、Caspase-12、XBP-1和ATF6蛋白表達(dá)情況

以往有研究證實(shí)OxLDL可通過(guò)激活ERK-Bax/Bcl-2信號(hào)通路導(dǎo)致RPE細(xì)胞凋亡[3]，但ERS是否參與尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，濃度大于25μg/mL的OxLDL作用于RPE細(xì)胞可引起細(xì)胞活力降低。進(jìn)一步通過(guò)Annexin V-FITC/PI染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，OxLDL處理組的RPE細(xì)胞凋亡比例增加。 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示凋亡相關(guān)酶Caspase-12在OxLDL作用下表達(dá)增加同時(shí)ERS相關(guān)蛋白CHOP、GRP78、XBP-1和ATF6表達(dá)上調(diào)。提示除了經(jīng)典的凋亡通路，OxLDL還可以通過(guò)ERS途徑引起RPE細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本次研究證實(shí)一定濃度OxLDL可通過(guò)ERS途徑導(dǎo)致RPE細(xì)胞凋亡，而通過(guò)調(diào)控ERS減少RPE細(xì)胞凋亡可能達(dá)到控制ARMD進(jìn)展的目的。