劉暢，趙繼榮，王昆，于文全，顧廣軍，卜海東，冷長(zhǎng)龍，葉萬(wàn)軍

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院,黑龍江省寒地果樹(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，黑龍江 牡丹江 157000；2.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 延安 716000； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，遼寧 興城 125100；4.牡丹江市東和林場(chǎng)，黑龍江 牡丹江 157041；5.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱 150030)

蘋(píng)果是世界四大水果之一，在我國(guó)栽種和生產(chǎn)面積均居世界首位[1]。蘋(píng)果含有豐富的類(lèi)黃酮物質(zhì)，類(lèi)黃酮是一種重要的酚類(lèi)代謝產(chǎn)物，包括花色素苷類(lèi)、黃酮醇類(lèi)和黃烷醇類(lèi)等五大類(lèi)[2]，在植物中廣泛存在，對(duì)生物合成起著非常重要的作用[3-4]。類(lèi)黃酮因具有抗氧化性[5]，抗逆性[6]，抗病毒[7-8]等作用，同時(shí)還具有較強(qiáng)的自由基清除能力，影響果實(shí)加工風(fēng)味[9]，近些年越來(lái)越受到學(xué)者關(guān)注，選育高類(lèi)黃酮蘋(píng)果品種也成了蘋(píng)果育種者的育種方向之一[10-11]。

黑龍江省屬于東北寒地中小蘋(píng)果栽培區(qū)，由于秋季晝夜溫差大，蘋(píng)果風(fēng)味獨(dú)特，口感極佳[12]。目前關(guān)于蘋(píng)果類(lèi)黃酮的研究大多集中在蘋(píng)果主產(chǎn)區(qū)，對(duì)東北寒地小蘋(píng)果的果實(shí)類(lèi)黃酮組分研究學(xué)者較少。本研究以龍帥、雞心果、齊早紅、龍紅、紫香和龍秋6個(gè)蘋(píng)果為試材通過(guò)高效液相色譜法進(jìn)行果實(shí)類(lèi)黃酮組分及含量分析，為了解寒地小蘋(píng)果果實(shí)類(lèi)黃酮組分特性及高類(lèi)黃酮功能性蘋(píng)果品種選育、開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)蘋(píng)果資源均采自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院果樹(shù)資源圃，選取龍帥、龍紅、龍秋等6個(gè)蘋(píng)果品種(見(jiàn)表1)，每個(gè)品種選擇樹(shù)勢(shì)一致，生長(zhǎng)健壯的果樹(shù)。在每株樹(shù)冠外圍東西南北4個(gè)方向同一高度隨機(jī)采集20個(gè)成熟果實(shí)，果實(shí)成熟標(biāo)準(zhǔn)參照王大江[13]的方法。將果實(shí)迅速送到中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)所國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行液氮保存，準(zhǔn)備待測(cè)。

表1 6個(gè)供試東北蘋(píng)果品種

1.2 試驗(yàn)試劑與方法

1.2.1 試驗(yàn)試劑。甲酸、乙腈、甲醇(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。原花青素B1、原花青素B2、原花青素B4、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲-半乳糖苷、槲-葡苷、槲皮苷、矢-3-0-半乳糖苷、矢-3-0-葡萄糖苷、花色素鼠李糖苷(標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，中國(guó)成都曼斯特公司)。

1.2.2 試驗(yàn)方法。樣品處理及類(lèi)黃酮組分含量測(cè)定參考聶繼云等[14]方法略有改動(dòng)。稱(chēng)取冷凍研磨后的蘋(píng)果皮混合樣2.0 g，加入使用80%乙醇5.0 mL，搖勻后放置在超聲波中超聲20 min后，10000 r/min離心機(jī)中的離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移到10.0 mL離心管中，使用5.0 mL 80%乙醇重復(fù)提取1次，上清液轉(zhuǎn)移到10.0 mL離心管中，合并2次提取上清液，定容到10 mL，吸取5 mL提取液在40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)出去乙醇，剩余2 mL水相分兩次過(guò)Oasis?HLB固相萃取小柱(固相萃取小柱首先用5 mL甲醇和5 mL純凈水活化，將樣品提取液倒入活化好的固相萃取小柱上，用5 mL甲醇次淋洗固相萃取小柱，棄去廢液，再用5 mL去離子水淋洗固相萃取小柱，棄去廢液)，用5 mL甲醇分2次淋洗小柱，收集濾液，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)收集的濾液至近干，甲醇定容5 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，待測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2017進(jìn)行計(jì)算和整理，采用SPSS 22.0進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蘋(píng)果品種類(lèi)黃酮各組分比例差異分析

圖1 不同蘋(píng)果品種果實(shí)類(lèi)黃酮各組分比例

6個(gè)蘋(píng)果品種只有龍秋含有12種類(lèi)黃酮組分，通過(guò)圖1可以看出所有品種中有4種組分所占比例最大，表兒茶素，所占比例變化范圍為10.65%～59.09%，其中比例最低的品種為龍紅，比例最高的品種為齊早紅；槲-半乳糖苷，所占比例變化范圍為3.87%～37.96%；其中比例最低的品種為龍秋，比例最高的品種為龍紅；槲-葡苷，所占比例變化范圍為5.98%～14.62%，其中比例最低的品種為齊早紅，比例最高的品種為紫香；槲皮苷，所占比例變化范圍為11.49%～27.61%，其中比例最低的品種為齊早紅，比例最高的品種為紫香。12種類(lèi)黃酮組分因品種不同，所占比例表現(xiàn)出較大差異。

2.2 不同蘋(píng)果品種間類(lèi)黃酮含量主成分分析

將6個(gè)品種的槲-半乳糖苷、槲皮苷、花色素鼠李糖苷等12個(gè)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，提取前3個(gè)主成分。由表2可知，第一成分的特征值5.226，方差貢獻(xiàn)率43.551%，為第一主成分。第二、三主成分的貢獻(xiàn)率分別是27.129%、16.449%。前3個(gè)主成分特征值大于1,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到88.804%，因此選這3個(gè)主成分作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表2 不同蘋(píng)果品種果實(shí)類(lèi)黃酮含量主成分分析

通過(guò)方差旋轉(zhuǎn)得到12個(gè)因子之間相關(guān)性大小，結(jié)果見(jiàn)表3。第一主成分中原花青素B1，原花青素B2，槲-半乳糖苷，槲-葡苷，槲皮苷和蘆丁對(duì)主成分產(chǎn)生正向影響，原花青素B1含量特征向量值最大為0.970，原花青素B2含量特征向量值為0.915，居第二位。因此，第一主成分主要與黃烷醇有關(guān)；第二主成分中花色素鼠李糖苷、原花青素B4和兒茶素對(duì)主成分產(chǎn)生正向影響，花色素鼠李糖苷含量特征向量值最大為0.895。第二主成分主要與花色苷有關(guān)；第三主成分中矢-3葡萄糖苷和表兒茶素對(duì)主成分產(chǎn)生正向影響且矢-3葡萄糖苷含量特征向量值最大為0.843，主要與花色苷有關(guān)，補(bǔ)充第二主成分。說(shuō)明黃烷醇類(lèi)物質(zhì)在類(lèi)黃酮當(dāng)中起重要作用。

表3 不同蘋(píng)果品種果實(shí)3個(gè)主成分特征向量

2.3 不同蘋(píng)果品種間類(lèi)黃酮含量相關(guān)性分析

通過(guò)對(duì)不同蘋(píng)果品種間類(lèi)黃酮組分含量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)類(lèi)黃酮各組分之間存在顯著相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)表4。其中槲-半乳糖苷和槲皮苷呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明槲皮苷含量隨槲-半乳糖苷含量增加而增加。兒茶素和矢-3-0-半乳糖苷、原花青素B4和花色素鼠李糖苷、表兒茶素和矢-3-0-葡萄糖苷含量均呈正相關(guān)，說(shuō)明黃烷醇與花色苷關(guān)系密切。原花青素B1與原花青素B2、蘆丁、槲-葡苷含量呈正相關(guān)，說(shuō)明黃烷醇與黃酮醇關(guān)系密切。進(jìn)一步證明黃烷醇在類(lèi)黃酮組分中起主要作用，與表3結(jié)果一致。

表4 不同蘋(píng)果品種果實(shí)類(lèi)黃酮含量相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

用HPLC方法進(jìn)行果樹(shù)果實(shí)類(lèi)黃酮檢測(cè)不但高效而且可靠[15-16]。本研究對(duì)供試的6個(gè)東北小蘋(píng)果品種進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)類(lèi)黃酮總含量分別是龍帥(105.49 mg/kg)、雞心果(66.97 mg/kg)、齊早紅(124.84 mg/kg)、龍紅(232.83 mg/kg)、紫香(91.84 mg/kg)和龍秋(169.36 mg/kg)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)龍帥以表兒茶素為主(32.78 mg/kg)，雞心果以槲皮苷為主(14.13 mg/kg)，齊早紅以表兒茶素為主(73.77 mg/kg)，龍紅以槲-半乳糖苷為主(88.38 mg/kg)，紫香以槲皮苷為主(25.36 mg/kg)，龍秋以?xún)翰杷貫橹?37.93 mg/kg)，通過(guò)對(duì)不同蘋(píng)果品種類(lèi)黃酮組分進(jìn)行測(cè)定并對(duì)含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)各組分含量存在明顯差異。

類(lèi)黃酮是果實(shí)重要功能性成分[17]，關(guān)于蘋(píng)果類(lèi)黃酮的組分及含量分析之前有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)果實(shí)類(lèi)黃酮在果皮和果肉中因品種不同而有明顯差異。聶繼云等[18]對(duì)不同產(chǎn)地的‘長(zhǎng)富2號(hào)’蘋(píng)果檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)果皮中有16種類(lèi)黃酮。本研究發(fā)現(xiàn)6個(gè)供試材料含量共檢測(cè)到12種類(lèi)黃酮，只有龍紅檢測(cè)到全部組分，根皮苷由于含量很少?zèng)]有計(jì)算在內(nèi)。表兒茶素含量范圍為10.20～73.77 mg/kg、槲-半乳糖苷含量范圍為5.36～88.38 mg/kg、槲皮苷含量范圍為11.82～49.64 mg/kg，三者占類(lèi)黃酮總含量57.48%。與聶繼云等學(xué)者研究結(jié)果不一致，分析可能是由于地理因素和生長(zhǎng)環(huán)境不同和大蘋(píng)果相比類(lèi)黃酮種類(lèi)含量少，但還需要增加品種進(jìn)行驗(yàn)證。崔志杰等[19]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)兒茶素和表兒茶素具有抗病毒等多種功能，乜蘭春等[20]研究發(fā)現(xiàn)果實(shí)果皮兒茶素和表兒茶素高于果肉，且含量越高，果實(shí)風(fēng)味越澀。本研究發(fā)現(xiàn)6個(gè)品種兒茶素和表兒茶素差異明顯，齊早紅表兒茶素(73.77 mg/kg)和龍秋兒茶素(37.93 mg/kg)含量均較高，對(duì)功能性蘋(píng)果開(kāi)發(fā)利用潛力很大。

研究進(jìn)一步采用了主成分分析法和相關(guān)性分析法對(duì)6種蘋(píng)果果實(shí)類(lèi)黃酮成分進(jìn)行分析。目前，這兩種方法在不同蘋(píng)果品種果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)價(jià)[21]以及蘋(píng)果種質(zhì)資源評(píng)價(jià)中得到廣泛的應(yīng)用[22]。Vrhovsek等[23]對(duì)金冠等不同蘋(píng)果測(cè)定發(fā)現(xiàn)，黃烷醇含量最高，并且同一類(lèi)黃酮中的各種組分含量存在明顯差異。本研究通過(guò)主成分分析把蘋(píng)果類(lèi)黃酮12個(gè)組分簡(jiǎn)化為3個(gè)主成分因子，且方差貢獻(xiàn)率累計(jì)達(dá)88.80%，其中黃烷醇類(lèi)物質(zhì)含量最高，與前人研究結(jié)果一致。

綜上所述，6個(gè)供試東北小蘋(píng)果品種檢測(cè)到黃酮醇，黃烷醇，花色苷3類(lèi)12種，在類(lèi)黃酮組成及含量上具有豐富多樣性。為類(lèi)黃酮組分提取及保健食品開(kāi)發(fā)提供原料，為東北小蘋(píng)果高類(lèi)黃酮品種的選育提供理論基礎(chǔ)。