張婷，李昂，孫建立

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 腫瘤六科，上海 200030；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 中醫(yī)科, 上海 264000；3.武漢市漢南區(qū)人民醫(yī)院 中醫(yī)科，武漢 430090)

靶向治療已成為肺癌的主要治療方法，對(duì)于EGFR基因敏感突變的患者效率達(dá)70%，且具有耐受性好、毒副作用小、生活質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，但是多項(xiàng)研究表明靶向治療NSCLC的中位無(wú)疾病進(jìn)展生存期僅有10個(gè)月左右[1-4]，如何延緩耐藥成為肺癌靶向治療研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

“證”是辨證論治的核心，我們以國(guó)醫(yī)大師劉嘉湘“扶正治癌”理論為指導(dǎo)[5]，通過(guò)對(duì)中醫(yī)辨證結(jié)合吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌后中醫(yī)證侯變化的特點(diǎn)進(jìn)行觀察分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吉非替尼治療后肺癌患者中醫(yī)證侯有獨(dú)特的變化規(guī)律，在國(guó)內(nèi)首先提出靶向治療肺癌后中醫(yī)病機(jī)特點(diǎn)以“熱毒傷陰，余毒未凈”為主[6]，擬養(yǎng)陰解毒方并進(jìn)一步探討了養(yǎng)陰解毒方對(duì)吉非替尼增敏的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

吉非替尼耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/R細(xì)胞由上海同濟(jì)大學(xué)附屬肺科醫(yī)院腫瘤研究所周彩存教授惠贈(zèng)。

1.1.2 動(dòng)物

Sprague-Dawley大鼠，10～11周齡，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量(350±50)g，60只，由上海新萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SYXK(滬)2010-0095]提供，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫25 ℃，濕度70%，自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)經(jīng)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.3 藥物及試劑

養(yǎng)陰解毒方(YYJD)由北沙參、天門(mén)冬、夏枯草、石上柏、山慈菇等組成，加水10倍量浸泡40 min，煎煮，沸后計(jì)時(shí)，煎煮1 h，過(guò)濾，藥渣加水10倍量，煎煮1 h，濾過(guò)，合并兩煎濾液，濃縮至一定稠度，真空干燥(60 ℃)，得浸膏粉70.7 g。每g干膏粉相當(dāng)于1.697 g生藥。

吉非替尼(G)：由英國(guó)AstraZeneca公司生產(chǎn)，上海阿斯利康公司提供；AnnexinV凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于BD公司；P-Akt、Akt抗體及GAPDH購(gòu)于CST公司；PTEN抗體購(gòu)于Abcam公司；CCK-8試劑盒、羊抗兔HRP標(biāo)記二抗及羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗購(gòu)于碧云天生物有限公司。

1.1.4 養(yǎng)陰解毒方含藥血清的制備

將SD大鼠60只隨機(jī)分為4組，每組15只。中藥分三個(gè)劑量組，高、中、低劑量分別為生藥35 g/(kg·d)、17.5 g/(kg·d)和8.75 g/(kg·d)，空白對(duì)照組以等體積生理鹽水，灌胃前禁食12 h。每日2次灌胃，共灌胃3 d，末次灌胃后1～2 h行腹主動(dòng)脈取血，采血后離心(2 000 r/min，10 min)，分離血清，各組混合成一無(wú)菌離心管，56 ℃水浴箱滅活抗體30 min，采用0.22 μm濾器除菌后分裝，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖抑制檢測(cè)

采用CCK-8法，抑制率按下列公式計(jì)算：抑制率(%)=[ (空白組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(空白組OD值-對(duì)照組OD值)]×100%，繪制量效曲線(xiàn)，計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。體外兩藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，用金正均法(即金氏公式法)求協(xié)同指數(shù)(Q值)，再判斷拮抗、相加、協(xié)同效果。

1.2.2 細(xì)胞凋亡和周期的檢測(cè)

將細(xì)胞接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)藥物處理72 h，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化，用70%乙醇固定4 h，孵育30 min后用碘化丙啶(400 μL)染色。立即用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。使用Annexin V凋亡細(xì)胞檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞DNA含量的測(cè)定，確定細(xì)胞在各細(xì)胞周期所占比例。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot檢測(cè)AKT、p-AKT及PTEN的表達(dá)

將需要抽提的蛋白的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，吸去培液，適量預(yù)冷的1×PBS洗滌2次，吸去PBS，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，4 ℃充分裂解細(xì)胞，將細(xì)胞刮入1.5 mL EP管中，95 ℃以上加熱10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇不同的凝膠濃度，以GAPDH作為內(nèi)參基因，同樣進(jìn)行以上操作。以p-AKT以及PTEN與GAPDH條帶吸光度比值作為其蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，并采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Kolmogrov-Smitnov法和Shapiro-Wlik法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，再用Levene法進(jìn)行方差齊性分析，若符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用一般線(xiàn)性模型進(jìn)行兩因素兩水平(2×2)析因設(shè)計(jì)的方差分析，多重組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。若經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后方差仍然不齊，則行Kruskal-Wallis法；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則進(jìn)行非參數(shù)多重秩和檢驗(yàn)，多重組間兩兩比較用Nemenyi法，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 養(yǎng)陰解毒方及其結(jié)合吉非替尼對(duì)人肺腺癌獲得性耐藥株P(guān)C9/R細(xì)胞增殖抑制作用

高、中、低劑量養(yǎng)陰解毒方組(YYJD組)根據(jù)含藥血清濃度分5組，與單藥吉非替尼組(G組)(5 μmol/L)作對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表1，通過(guò)計(jì)算養(yǎng)陰解毒方的IC50，選擇高劑量養(yǎng)陰解毒方含藥血清濃度為8%，中劑量為8.8%，低劑量為41.7%，與不同濃度吉非替尼聯(lián)合對(duì)PC9/R的作用，結(jié)果見(jiàn)表2。均為培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后檢測(cè)。

表1 養(yǎng)陰解毒方對(duì)耐藥人肺腺癌PC9/R的抑制率

表2 養(yǎng)陰解毒方聯(lián)合吉非替尼對(duì)耐藥人肺腺癌PC9/R的抑制率

研究結(jié)果顯示養(yǎng)陰解毒方較吉非替尼而言有較好的抑制耐藥細(xì)胞的作用，并有較好的量效關(guān)系。吉非替尼聯(lián)合養(yǎng)陰解毒方各劑量組均能在吉非替尼較低濃度時(shí)增強(qiáng)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，養(yǎng)陰解毒方中、低劑量聯(lián)合吉非替尼干預(yù)組在低濃度均比吉非替尼單藥組能抑制細(xì)胞增殖。以金正均法計(jì)算藥物交互作用，吉非替尼聯(lián)合養(yǎng)陰解毒方低劑量各組Q值均>0.85，具有效應(yīng)相加及協(xié)同作用，尤其為吉非替尼低濃度組加養(yǎng)陰解毒方低劑量組協(xié)同作用明顯；吉非替尼最低濃度藥物敏感度從5.506%提高到57.29%,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 養(yǎng)陰解毒方對(duì)耐藥人肺腺癌PC9/R細(xì)胞凋亡的影響

吉非替尼(5 μmol/L)和養(yǎng)陰解毒方(低劑量組含藥血清濃度為40%)分別作用于PC9/R細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡比例結(jié)果見(jiàn)表3。養(yǎng)陰解毒方可誘導(dǎo)PC9/R細(xì)胞凋亡，抑制正常細(xì)胞增殖并增加早期凋亡細(xì)胞，均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；兩藥聯(lián)用組較吉非替尼單藥組可明顯提高吉非替尼誘導(dǎo)PC9/R細(xì)胞凋亡的能力，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且兩藥聯(lián)用組較養(yǎng)陰解毒方組可促使細(xì)胞凋亡速度加快，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果表明養(yǎng)陰解毒方可誘導(dǎo)人肺腺癌獲得性吉非替尼耐藥PC9/R細(xì)胞凋亡，抑制正常細(xì)胞增殖并增加早期凋亡細(xì)胞，兩藥聯(lián)用組較吉非替尼單藥組可明顯提高吉非替尼誘導(dǎo)PC9/R細(xì)胞凋亡的能力。

表3 養(yǎng)陰解毒方含藥血清及其結(jié)合吉非替尼誘導(dǎo)PC9/R細(xì)胞凋亡的作用

2.3 養(yǎng)陰解毒方對(duì)耐藥人肺腺癌PC9/R細(xì)胞周期的影響

吉非替尼和養(yǎng)陰解毒方分別作用于PC9/R細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組別細(xì)胞周期情況如表4。養(yǎng)陰解毒方組及聯(lián)合用藥組干預(yù)后人肺腺癌PC9/R細(xì)胞S期(DNA復(fù)制期)均較吉非替尼單藥細(xì)胞周期縮短，有明顯差異(P<0.01)；G0-G1期(DNA合成前間期)養(yǎng)陰解毒方組及聯(lián)合用藥組均能較吉非替尼單藥明顯使細(xì)胞停滯在此期，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而G2-M期(DNA合成后間期)吉非替尼單藥組與養(yǎng)陰解毒方組有明顯細(xì)胞比例增高，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，聯(lián)合用藥組較吉非替尼單藥組細(xì)胞差異無(wú)明顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明養(yǎng)陰解毒方可有效抑制耐藥細(xì)胞的DNA合成活性，養(yǎng)陰解毒方可使耐藥細(xì)胞停滯在DNA合成前、后間期，聯(lián)合用藥可使耐藥細(xì)胞停滯在DNA合成前間期。

表4 養(yǎng)陰解毒方及其結(jié)合吉非替尼對(duì)耐藥人肺腺癌PC9/R細(xì)胞周期的影響

2.4 養(yǎng)陰解毒方對(duì)PC9及PC9/R細(xì)胞P-Akt和P-Akt表達(dá)的影響

各組細(xì)胞經(jīng)干預(yù)48h后，收集細(xì)胞，Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞AKT通路活化表達(dá)水平，60KD處出現(xiàn)p-AKT(Thr308)及p-AKT(Ser473)的特異性顯色帶，結(jié)果如表5，圖1。人肺腺癌吉非替尼耐藥PC9/R細(xì)胞株在吉非替尼干預(yù)下AKT兩主要活化位點(diǎn)表達(dá)均明顯超過(guò)人肺腺癌吉非替尼敏感細(xì)胞株P(guān)C9細(xì)胞株，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；養(yǎng)陰解毒方組與聯(lián)合用藥組均比單藥吉非替尼單藥干預(yù)組能加強(qiáng)抑制PC9/R的p-AKT活化位點(diǎn)Thr308的磷酸化，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，同樣也能加強(qiáng)抑制p-AKT活化位點(diǎn)Ser473的磷酸化，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。從表及圖中亦可見(jiàn)縱向比較，在人肺腺癌吉非替尼敏感PC9細(xì)胞株及其耐藥亞株中，P-AKT活化位點(diǎn)Ser473的活化程度均要比Thr308高。

表5 養(yǎng)陰解毒方及其結(jié)合吉非替尼對(duì)PC9及PC9/R的P-AKT表達(dá)的影響

注:每組第一柱結(jié)合位點(diǎn)為T(mén)hr308,第二柱結(jié)合位點(diǎn)為Ser473

2.5 養(yǎng)陰解毒方及其結(jié)合吉非替尼對(duì)PC9及PC9/R細(xì)胞PTEN表達(dá)的影響

各組細(xì)胞經(jīng)干預(yù)48h后，收集細(xì)胞，Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞PTEN表達(dá)水平，54KD處出現(xiàn)PTEN的特異性顯色帶，結(jié)果如表6，圖2。人肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/R的PTEN表達(dá)顯著低于敏感細(xì)胞株P(guān)C9，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；聯(lián)合用藥組耐藥株P(guān)C9/R的PTEN表達(dá)顯著高于其余各組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中養(yǎng)陰解毒方干預(yù)的耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/R與吉非替尼干預(yù)的敏感細(xì)胞株P(guān)C9無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表6 養(yǎng)陰解毒方及其結(jié)合吉非替尼對(duì)PC9及PC9/R的PTEN表達(dá)的影響

圖2 各干預(yù)組PTEN表達(dá)的檢測(cè)

3 討論

隨著靶向治療在肺癌中的廣泛應(yīng)用，中醫(yī)藥結(jié)合靶向治療的研究也越來(lái)越多，如何運(yùn)用中藥延緩吉非替尼吉非替尼的耐藥成為研究的方向之一。本課題組前期研究[6-7]發(fā)現(xiàn)經(jīng)吉非替尼治療后肺癌患者有從氣虛向氣陰兩虛、氣陰兩虛向陰虛轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，顯示吉非替尼治療后肺癌患者中醫(yī)證侯有獨(dú)特的變化規(guī)律，在國(guó)內(nèi)首先提出吉非替尼治療肺癌后中醫(yī)病機(jī)特點(diǎn)為以“熱毒傷陰，余毒未凈”為主，論治以養(yǎng)陰解毒法為主。結(jié)合國(guó)醫(yī)大師劉嘉湘對(duì)肺癌靶向患者中藥治療的經(jīng)驗(yàn)，選擇北沙參、天門(mén)冬、夏枯草、石上柏、山慈菇等中藥組成養(yǎng)陰解毒方，進(jìn)行系列的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究[8]。本課題選擇吉非替尼耐藥的人肺腺癌PC9/R細(xì)胞株，研究養(yǎng)陰解毒方及其結(jié)合吉非替尼的作用和機(jī)制，結(jié)果顯示養(yǎng)陰解毒方對(duì)耐藥人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9/R細(xì)胞的增殖有抑制作用，并顯示一定的量效關(guān)系，養(yǎng)陰解毒方高、中、低劑量組均能夠在吉非替尼低劑量應(yīng)用時(shí)增加人肺腺癌PC9/R細(xì)胞株對(duì)吉非替尼的敏感性；尤以低劑量組效果更優(yōu)，兩藥聯(lián)合使用有明顯的增效作用。養(yǎng)陰解毒方單藥以及聯(lián)合用藥組均能抑制人肺腺癌細(xì)胞PC9的DNA復(fù)制；吉非替尼誘導(dǎo)細(xì)胞停滯在G0-G1期，而養(yǎng)陰解毒方組及聯(lián)合用藥組誘導(dǎo)細(xì)胞停滯在G2-M期，證實(shí)養(yǎng)陰解毒方所誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制與吉非替尼并不完全相同。養(yǎng)陰解毒方以及聯(lián)合用藥組均可抑制人肺腺癌獲得性耐藥細(xì)胞PC9/R的增殖活性(DNA復(fù)制期細(xì)胞減少)，使細(xì)胞停滯在G0-G1期；吉非替尼單藥組DNA復(fù)制期細(xì)胞活躍，G2-M期細(xì)胞數(shù)較其余各組增多。證實(shí)養(yǎng)陰解毒方及吉非替尼對(duì)原代細(xì)胞及耐藥細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡機(jī)制有差異，養(yǎng)陰解毒方及聯(lián)合用藥組對(duì)耐藥細(xì)胞株P(guān)C/R有明顯的抑制作用，且與其在原代細(xì)胞PC9誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制并不完全相同。

研究表明EGFR-TKI的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜[9]，主要為EGFR基因突變或靶點(diǎn)缺失，避開(kāi)EGFR通路的其他TK受體活化，胞內(nèi)EGFR下游信號(hào)蛋白非依賴(lài)性或組成性活化。其中，PI3K/Akt信號(hào)通路在EGFR-TKI耐藥中扮演了重要角色，而PTEN可調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路，與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。PTEN是一個(gè)具有雙特異磷酸酶活性的抑癌因子[10-11]，是PI3K/Akt信號(hào)級(jí)聯(lián)通路的主要負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，PTEN功能的缺失導(dǎo)致Akt通路的過(guò)度活化，在EGFR抑制劑耐藥過(guò)程中起著重要的作用，外源性PTEN基因?qū)θ朔伟┘?xì)胞株SPC-A-1增殖凋亡及侵襲有明顯的抑制作用[12]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示吉非替尼獲得性耐藥后，PC9/R表現(xiàn)出了磷酸化AKT的表達(dá)上升，可能與PI3K/AKT信號(hào)通路被旁路激活有關(guān)，而敏感細(xì)胞PC9在此通路仍被抑制。并從中可見(jiàn)由于Ser473結(jié)合位點(diǎn)磷酸化的表達(dá)大于Thr308的磷酸化表達(dá)，可能為主要的AKT活化的因素，而養(yǎng)陰解毒方及兩藥聯(lián)合可以有效抑制從Ser473位點(diǎn)激活A(yù)KT磷酸化的表達(dá)，養(yǎng)陰解毒方可通過(guò)干擾AKT的磷酸化逆轉(zhuǎn)吉非替尼的耐藥。

耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/R的PTEN表達(dá)低下，養(yǎng)陰解毒方聯(lián)合用藥顯示出其顯著的促進(jìn)抑癌基因PTEN表達(dá)的能力，這可能與養(yǎng)陰解毒方可對(duì)Ser380、Thr382、Thr383位點(diǎn)磷酸化的激活有關(guān)。養(yǎng)陰解毒方單藥仍可顯示出其糾正抑癌基因PTEN低表達(dá)的作用，在耐藥細(xì)胞適應(yīng)濃度下可提高其抑癌基因的表達(dá)至吉非替尼敏感株P(guān)C9的同等水平。

綜上所述，養(yǎng)陰解毒方可抑制重要耐藥發(fā)生信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白AKT在Thr308與Ser473位點(diǎn)的活化，可調(diào)節(jié)耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/R的PTEN的表達(dá)恢復(fù)到非耐藥細(xì)胞表達(dá)水平；兩藥聯(lián)用可顯著上調(diào)PTEN的表達(dá)，抑制PI3K/AKT通路活化的信號(hào)，從而起到抑制腫瘤生長(zhǎng)、逆轉(zhuǎn)耐藥的雙重作用，為進(jìn)一步開(kāi)展養(yǎng)陰解毒方的臨床研究提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。