孫建平, 劉雅輝, 左永梅, 韓民利, 張虹偉, 呂晶晶

鹽地堿蓬根際土壤細菌群落結構及其功能*

孫建平, 劉雅輝**, 左永梅, 韓民利, 張虹偉, 呂晶晶

(河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所/河北省鹽堿地綠化工程技術中心/唐山市耐鹽植物重點實驗室 唐山 063299)

鹽地堿蓬作為生物改良鹽堿地的理想材料, 其根際土壤微生物對土壤改良發(fā)揮著重要作用。為了深入探索環(huán)渤海濱海鹽堿地堿蓬根際土壤細菌群落結構組成及其功能, 采用Illumina Misep高通量測序平臺對環(huán)渤海地區(qū)濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤和裸地土壤進行測序。從16個樣本中獲得有效序列734 792條, 4 285個OTUs, 歸屬于41門、100綱、282目、400科、892屬、1 577種。鹽地堿蓬根際土壤細菌群落由變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎曲門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、藍藻細菌門(Cyanobacteria)、髕骨細菌門(Patescibacteria、浮霉菌門(Planctomycetes)組成。Alpha多樣性計算結果表明, 鹽地堿蓬根際土壤細菌群落結構多樣性高并與裸地土壤間差異顯著; LEfSe (LDA Effect Size)分析發(fā)現(xiàn), 鹽地堿蓬與裸地差異指示種明顯不同。PCoA與相關性Heatmap表明, 鹽地堿蓬、速效氮、速效鉀、速效磷、電導率是影響土壤細菌目類水平群落組成的主要因子。PICRUSt (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)分析表明微生物群落在新陳代謝等40個功能方面鹽地堿蓬根際土壤比裸地土壤高。本研究表明鹽地堿蓬覆蓋能夠降低土壤鹽分, 增加土壤養(yǎng)分, 對土壤細菌群落多樣性及其功能有積極作用。

高通量測序; 濱海鹽堿地; 鹽地堿蓬; 根際土壤; 細菌群落結構; 細菌群落功能

土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)功能中起重要的作用, 其多樣性不僅能夠描述任何一種復雜生態(tài)環(huán)境, 還可以較早地反映該環(huán)境的變化, 已被認為是生態(tài)系統(tǒng)中重要的生物學指標[1]。在土壤微生物中, 細菌的數(shù)量和種類最多、分布最廣泛且代謝功能潛力巨大, 參與碳、氮物質循環(huán)、土壤結構形成、促進植物生長以及改善生態(tài)環(huán)境等過程[2]。植物為微生物提供營養(yǎng)物質, 如分泌物質、落葉、花粉脫落以及枯死的植物殘體, 微生物分解無機物為植物生長提供營養(yǎng), 這些過程均發(fā)生在根際, 因此研究根際土壤細菌群落多樣性及其功能, 有助于了解植物、土壤微生物及其環(huán)境之間的關系。 濱海鹽堿土壤屬于極端環(huán)境, 其環(huán)境的復雜多樣性造就了物種豐富多樣性, 物種的多樣性預示著物種功能的多樣性。微生物獨特的遺傳特性、生理功能影響著植物的生存環(huán)境[3], 因此濱海鹽堿土壤是研究土壤微生物細菌群落與耐鹽植物關系的天然實驗室。鹽地堿蓬()是藜科(Chenopodiaceae)堿蓬屬植物, 不但在食用和藥用領域備受矚目, 也是用于開發(fā)利用鹽堿地的優(yōu)勢植物之一[4]。已有研究表明, 鹽地堿蓬的根系能分泌有機酸, 植物殘體分解后產(chǎn)生的腐殖酸能夠降低土壤堿性, 改善土壤理化性質, 減少土壤水分損失, 還能增加土壤中微生物的數(shù)量和酶活性[5-8]。目前對于鹽地堿蓬的微生物研究多局限于純培養(yǎng)法的測定與分析, 而針對其微生物群落結構的研究報道很少, 尤其是用分子生物學方法研究鹽地堿蓬根際土壤微生物群落結構及功能尚鮮有報道。因此明確鹽地堿蓬根際土壤中的細菌多樣性優(yōu)勢物種及功能, 可為利用鹽地堿蓬根系原生耐鹽微生物改善鹽堿地微環(huán)境質量, 實施安全有效的鹽堿地生物改良措施提供土壤微生物方面的理論依據(jù)。

近年來, 高通量測序技術發(fā)展迅速, 它能夠快速揭示原位環(huán)境中微生物群落的復雜性和多樣性[9-11]。本研究采用Misep高通量測序方法, 對鹽地堿蓬根際土壤細菌進行16s rRNA基因測序, 分析環(huán)渤海地區(qū)濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤的細菌群落結構, 探索細菌群落結構與環(huán)境因子的關系, 結合PICRUSt (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)分析預測鹽地堿蓬根際土壤細菌的功能, 不僅為環(huán)渤海地區(qū)濱海鹽堿地鹽地堿蓬的生長和生物改良措施的應用提供支撐, 也為今后研發(fā)土壤改良劑奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 研究地點與樣品采集

以河北、山東、天津的濱海鹽堿地為研究區(qū), 其緊臨渤海灣, 主要由海相沉積物和海陸交互層沉積的黏性土、粉土及砂類土組成, 土壤類型為濱海鹽土。環(huán)渤海地區(qū)光照充足, 年日照時數(shù)2 400~3 000 h,比山麓平原區(qū)多200 h左右; 年平均氣溫10.8~ 13.3 ℃, 無霜期180~200 d; 低平原區(qū)年降水量450~550 mm, 濱海平原區(qū)年降水量600~700 mm, 80%的降水主要集中在7—9月[12]。該區(qū)屬暖溫帶半濕潤季風性氣候, 光照充足, 四季分明, 其中春季干旱少雨、夏季炎熱多雨、秋季冷暖適中、冬季寒冷干燥[13]。

采用GPS定位, 確定鹽地堿蓬的采樣區(qū)塊(表1)。在每個采樣區(qū)域, 隨機選取3個樣方(1 m×1 m), 從每個樣方中隨機采集植物樣10株, 晃動根部, 去除根部松散的土壤后, 使用無菌刷子從根部收集殘留土壤, 做為根際土壤; 同一樣方“S”點取0~10 cm土層的土壤。土壤樣本等量混合均勻后, 分成兩部分。一部分裝入15 mL的離心管, 放入液氮罐速凍, 轉移到實驗室的-80 ℃冰箱, 用于樣本的高通量測序; 另一部分被密封在自封袋中, 自然風干過篩, 用于測定土壤的化學性質。取同一地區(qū)裸地的0~10 cm土壤作為對照。

表1 樣地基本概況

D: 裸地土壤; J: 堿蓬根際土壤。D: bare land soil; J: rhizosphere soil of.

1.2 土壤化學性質指標的測定

堿解氮采用堿解擴散法測定[14]; 速效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定[14]; 速效鉀采用火焰光度計法測定[14]; pH采用5︰1水土比浸提, 用PHSJ-4A型pH計測定[14]; 電導率(EC)采用DDSJ-308F儀器測定。

1.3 土壤細菌的DNA提取和高通量測序

從每個混合樣本(=16)中稱取0.5 g土壤, 使用MP-soil試劑盒提取DNA, 利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量;用338F(5′-ACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增[15],每個樣本3次重復。將同一個樣本的PCR產(chǎn)物混合后經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測和QuantiFluor?-ST定量檢測后, 送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司, 在Miseq PE300平臺上進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始測序序列使用Trimmomatic軟件質控, 使用FLASH軟件進行拼接, 使用UPARSE軟件根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類, 使用UCHIME軟件剔除嵌合體[16]。利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋, 比對Silva數(shù)據(jù)庫, 設置比對閾值為70%[17]。

利用Mothur軟件計算Alpha多樣性指數(shù)(Sobs、Simpson、Shannon、Chao、Ace、Coverage); 利用R語言工具制作稀釋曲線、多級物種Sunburst分析鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤細菌群落的組成; 利用Circos-0.67-7軟件制作Circos圖, 分析鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤優(yōu)勢物種組成比例及其在樣本中的分布比例; 利用LEfSe軟件, 根據(jù)分類學組成對鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤進行線性判別分析(LDA), 找出對鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤產(chǎn)生顯著性差異影響的群落; 利用R語言中PCoA分析鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤間的菌群結構差異; 利用R語言工具制作相關性Heatmap圖, 分析環(huán)境因子與細菌目水平群落結構的關系; 利用FastTree軟件, 通過目分類水平信息對應的序列, 根據(jù)最大似然法ML構建進化樹, 使用R語言作圖繪制進化樹; 采用PICRUSt方法將現(xiàn)有的16S rRNA基因測序數(shù)據(jù)與KEGG數(shù)據(jù)庫對比, 比較功能基因在生物代謝通路上的豐度差異; 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理, 采用獨立樣本檢驗, 分析在≤0.05水平上的樣本間顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤及裸地土壤的化學性質

通過對鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤化學性質的測定, 結果顯示, 除pH外, 鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤的化學性質間均差異顯著(表2)。與裸地土壤相比, 鹽地堿蓬根際土壤均不同程度增加了堿解氮、速效磷、速效鉀和有機質含量, 降低了土壤的鹽分, 尤其堿解氮, 鹽地堿蓬根際土壤增加了238.47%。表明鹽地堿蓬能夠增加土壤的養(yǎng)分, 降低土壤的鹽分。

表2 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤及裸地土壤的化學性質

同列不同小寫字母表示差異顯著(≤0.05)。Different lowercase letters in the same column indicate significant differences at≤0.05 level.

2.2 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤細菌群落多樣性特征

基于種的分類水平對鹽地堿蓬根際土壤和裸地土壤微生物群落多樣性指數(shù)進行分析, 結果(表3)表明, 與裸地土壤相比, 鹽地堿蓬根際土壤細菌的Sobs、香農(nóng)指數(shù)較高, 兩者差異不顯著; 辛普森指數(shù)、Ace、Chao指數(shù)較低, 其中辛普森指數(shù)兩者差異顯著。由此可見鹽地堿蓬根際土壤細菌群落的物種多樣性略高于裸地, 鹽地堿蓬根際土壤細菌群落的物種均勻度低于裸地。

表3 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤及裸地土壤細菌的生物多樣性指數(shù)

*表示裸地土壤和鹽地堿蓬根際土壤在≤0.05水平差異顯著。* means significant differences between bare land soil and rhizosphere soil ofat≤0.05.

鹽地堿蓬根際土壤中共有3 872個OTUs, 裸地土壤共有2 410個OTUs, 有1 997個OTUs均出現(xiàn)在鹽地堿蓬根際土壤和裸地土壤中, 分別占各自OTUs總數(shù)的51.58%和82.86%。在鹽地堿蓬根際土壤中特有的OTUs 1 875個, 占鹽地堿蓬根際土壤OTUs總數(shù)的48.42%; 裸地土壤中特有的OTUs 413個, 占裸地OTUs 總數(shù)的17.14%。這些數(shù)據(jù)表明, 鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤OTU組成存在差異, 鹽地堿蓬根際土壤不僅OTU數(shù)目比較多, 還存在更多的特有OTU。

稀釋曲線(圖1)表明, 鹽地堿蓬根際土壤細菌多樣性高于裸地對照, 曲線均趨于平緩, 結合基于種分類水平的各樣本文庫的覆蓋度均在99.46%以上(表3), 說明基于本試驗的測序深度, 土壤中包括的稀有物種在內(nèi)的所有微生物均已得到分析, 比較真實地反映了該研究區(qū)的微生物群落組成。

2.3 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤細菌群落組成

通過對濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤及裸地土壤樣本進行高通量測序, 共得到有效序列734 792條, 為避免各樣品微生物量的差異, 按最小樣本序列數(shù)進行樣本序列抽平處理, 得到標準化數(shù)據(jù)用于后續(xù)統(tǒng)計分析, 每個樣本的有效序列為24 065條, 獲得41門、100綱、282目、400科、892屬、1 577種、4 285 OTUs。圖2選擇目分類學水平, 從里圈到外圈依次展示鹽地堿蓬根際土壤和裸地土壤中域、界、門、綱、目水平的物種組成(相對豐度>1%)。鹽地堿蓬根際土壤由放線菌門(Actinobacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、放線菌目(Actinomarinales)(共占比55.3%), 綠彎菌門(Chloroflexi)、厭氧蠅菌目(Anaerolineae)與SBR1031目(共占比15.3%), 藍藻細菌門(Cyanobacteria)、產(chǎn)氧光合細菌綱(Oxyphotobacteria)與念珠藻目(Nostocales)(共占比14.7%), 芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes)、未定屬芽單胞菌目(norank-Gemmatimonadetes)(共占比8.8%), 變形菌門(Proteobacteria)、丙型變型菌綱(Gammaproteobacteria)與外硫螺菌目(Ectothiorhodospirales)(共占比5.5%)組成。裸地土壤由變形菌門、丙型變型菌綱與外硫螺菌目(共占比36.9%), 芽單胞菌門、芽單胞菌綱、未定屬芽單胞菌目(共占比15.5%), 變形菌門、丙型變型菌(從綱到目)(共占比17.3%)組成。由此可以得出鹽地堿蓬的根際土壤細菌物種的分布和比例與裸地土壤差異顯著, 鹽地堿蓬根際土壤的優(yōu)勢物種為放線菌, 裸地土壤中優(yōu)勢物種是變形菌, 鹽地堿蓬的覆蓋增加了微生物群落結構的多樣性, 提高了放線菌的比例, 新增了綠彎菌門、厭氧蠅菌目、SBR1031目、藍藻細菌門、產(chǎn)氧光合細菌綱、念珠藻目的分布。

圖1 濱海鹽地堿蓬根際土壤及裸地土壤細菌的稀釋曲線

2.4 鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤優(yōu)勢物種組成比例及其在樣本中的分布比例

Circos圖不僅反映了每組樣本的優(yōu)勢物種組成比例, 同時也反映了各優(yōu)勢物種在不同樣本中的分布比例?；陂T的分類水平下, 不同樣本的優(yōu)勢物種組成和比例差異明顯(圖3), 鹽地堿蓬根際土壤中優(yōu)勢物種為變形菌門(30.0%)、放線菌門(22.0%)、綠彎曲門(15.0%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(9.4%)、芽單胞菌門(5.0%)、酸桿菌門(Acidobacteria) (5.5%)、厚壁菌門(Firmicutes)(3.8%)、藍藻細菌門(4.1%)、髕骨細菌門(Patescibacteria) (1.3%)、浮霉菌門(Planctomycetes)(1.8%); 裸地土壤中優(yōu)勢物種為變形菌門(43.0%)、放線菌門(14.0%)、綠彎曲門(10.0%)、擬桿菌門(11.0%)、芽單胞菌門(10.0%)、酸桿菌門(2.3%)、厚壁菌門(2.5%)、髕骨細菌門(1.7%)。各優(yōu)勢菌門在樣本中的分布比例有差異, 變形菌門、放線菌門、綠彎曲門、擬桿菌門、芽單胞菌門、酸桿菌門、厚壁菌門、藍藻細菌門、髕骨細菌門、浮霉菌門在裸地土壤和鹽地堿蓬根際土壤中分布的情況依次為59%和41%、39%和61%、41%和59%、55%和45%、67%和33%、30%和70%、40%和60%、2%和98%、56%和44%、33%和67%。其中藍藻細菌門絕大部分在鹽地堿蓬土壤中。

2.5 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤中的特殊群落及影響力

了解到樣本中物種的整體構成后, 就可以進行不同樣本之間的對比。PCoA分析即主坐標分析, 是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法, 可用來研究不同樣本之間群落組成的相似性或差異性, 圖中不同形狀的點表示來源于不同的樣本, 兩樣本點越接近, 表明兩樣本物種組成越相似。圖4中鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤兩個樣本沒有重疊部分, 樣本點距離較遠, 說明鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤的微生物群落結構組成不相似,軸(13.59%)與軸(53.39%)的累計貢獻量達到66.98%, 表明鹽地堿蓬的覆蓋可以解釋兩個樣本間微生物群落結構組成不同的原因。

通過上述分析判斷出鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤之間具有顯著差異。比較微生物群落差異的另一個主要目的是確定組間的顯著性差異物種, 為此使用LEfSe分析, 首先使用non-parametric factorial Kruskal-Wallis (KW) sum-rank test(非參數(shù)因子克魯斯卡爾-沃利斯秩和驗檢)檢測不同分組間豐度差異顯著的物種, 并且判斷顯著差異物種是否趨于同一分類級別。其次, 采用線性判別分析(LDA)來估算每個組分(物種)豐度對差異效果影響的大小。因此本研究從域到屬級對鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤進行LEfSe分析, 檢測具有顯著豐度差異的特征, 僅LDA得分值大于4的被展示(圖5)。鹽地堿蓬根際土壤中差異指示種為藍藻細菌門、酸桿菌門、甲型變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)、產(chǎn)氧光合細菌綱、綠彎菌綱(Chloroflexia)、根瘤菌目(Rhizobiales)、念珠藻目、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)、芽孢桿菌屬(), 而裸地土壤差異指示種包括丙型變形菌(從綱到屬)、外硫螺菌目、硫堿螺旋菌科(Thioalkalispiraceae)、巴紐爾斯菌Balneolaceae(從目到科)、甲型變形桿菌(從目到屬)、嗜硫鹽菌屬()。以上物種均對鹽地堿蓬根際土壤和裸地土壤之間群落結構組成的差異起到非常重要的影響。

圖2 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤細菌群落組成

Fig. 2 Composition of the bacterial community in rhizosphere soil ofand bare soil in the coastal saline-alkali land

圖3 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤(J)與裸地土壤(D)優(yōu)勢物種組成比例及其在樣本中的分布比例

左半圈表示樣本中物種組成情況, 外層彩帶顏色代表來自哪一分組, 內(nèi)層彩帶顏色代表物種, 長度代表該物種在對應樣本中的相對豐度; 右半圈表示該分類學水平下物種在不同樣本中的分布比例情況, 外層彩帶顏色代表物種, 內(nèi)層彩帶顏色代表不同分組, 長度代表該樣本在某一物種中的分布比例。The left half circle shows the species composition in the sample, the color of the outer ribbon represents the group from which it comes, the color of the inner ribbon represents the species, and the length represents the relative abundance of the species in the corresponding sample. The right half circle shows the distribution proportion of the species in differentsamplesunder the taxonomic level, the outer ribbon represents the species, and the color of the inner ribbon represents different groups, the length represents the distribution proportion of the sample in a certain species.

圖4 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤組間比較分析

D: 裸地土壤; J: 鹽地堿蓬根際土壤。D: bare land soil; J: rhizosphere soil of.

圖5 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤中的特殊群落及影響力

D: 裸地土壤; J: 鹽地堿蓬根際土壤。不同顏色節(jié)點表示在對應組別中顯著富集, 且對組間差異存在顯著影響的微生物類群; 淡黃色節(jié)點表示在不同分組中均無顯著差異, 或對組間差異無顯著影響的微生物類群; 小寫字母代表差異指示種, 其中p代表門, c代表綱, o代表目, f代表科, g代表屬。D: bare land soil; J: rhizosphere soil of. The nodes in different colors represent the microbial groups which are significantly enriched in the corresponding groups and have a substantial impact on between-group variance. The yellowish nodes denote the microbial groups which are not significantly different between groups and or have no significant effect on between-group variance. The lowercase letters represent difference indicator species, of which “p” means phylum, “c” means class, “o” means order, “f” means family and “g” means genus.

2.6 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤的系統(tǒng)發(fā)生進化關系

為了解目水平物種進化關系, 將相對豐度排名前20的目所對應的OTUs數(shù)據(jù)進行多序列比對, 通過最大似然法構建系統(tǒng)發(fā)生進化樹(圖6), Bootstrap值設置為1 000次重復, 以揭示濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤之間細菌的進化關系。結果發(fā)現(xiàn)物種共屬于8個門, 分別為放線菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門、藍藻細菌門、綠彎曲門、擬桿菌門、酸桿菌門、變形菌門。Actinomarinales、Propionibacterial、微球菌目(Micrococcales)、微絲藻菌目(Microtrichales)屬于放線菌門, Thermoanaerobaculale屬于酸桿菌門, 根瘤菌目、紅桿菌目(Rhodobacterales)、鞘脂單胞菌目、粘球菌目(Myxococcales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、unclassified-Gammaproteobacteria屬于變形菌門, 芽孢桿菌目(Bacillales)屬于厚壁菌門, SBR1031、熱微菌目(Thermomicrobiales)屬于綠彎曲門, 念珠藻目屬于藍藻細菌門, 巴紐爾斯菌目、噬纖維菌目(Cytophagales)、黃桿菌目(Flavobacteriales)屬于擬桿菌門, 其中屬于擬桿菌門的巴紐爾斯菌目在裸地土壤所占比例高。

2.7 濱海鹽堿地土壤細菌目類水平群落與環(huán)境因子的相關分析

影響樣本菌群組成的環(huán)境因子很多, 但其中有很多環(huán)境因子之間具有較強多重共線性關系, 因此在進行環(huán)境因子分析前, 優(yōu)先進行了環(huán)境因子篩選,環(huán)境因子的VIF值均在4以下, 在目分類水平下選取總豐度前20的物種對細菌群落組成與環(huán)境因子進行相關性Heatmap分析。結果(圖7)表明, 土壤鹽分、堿解氮、速效磷、速效鉀是影響鹽堿地土壤細菌群落的主要環(huán)境因子, 微絲藻菌目、噬纖維菌目、鞘脂單胞菌目、熱微菌目、微球菌目、根瘤菌目、念珠藻目喜歡養(yǎng)分高的環(huán)境; 外硫螺菌目與EC呈極顯著正相關, 與堿解氮、速效鉀、速效磷呈極顯著負相關, 巴紐爾斯菌目與EC呈極顯著正相關, 與堿解氮呈顯著負相關, γ變形菌目未定屬unclassified-c-Gammaproteobacteria (unclassified表示目前采用的數(shù)據(jù)庫中未能找到與之相匹配的分類信息)與EC呈顯著正相關, 與堿解氮、速效鉀呈顯著負相關, 這為尋找喜歡鹽分與寡營養(yǎng)的微生物提供了可能性。

2.8 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤的PICRUSt功能預測

針對Pathway, 運用PICRUSt軟件獲得鹽地堿蓬根際土壤和裸地土壤代謝通路的3個水平信息及其豐度, Pathway level 1有6條代謝通路, Pathway level 2有37條代謝通路, Pathway level 3有304條代謝通路。在相似的鹽堿環(huán)境條件下, 鹽地堿蓬根際土壤微生物和裸地土壤的微生物群落代謝通路相似, 但是代謝通路的豐度值不同。其中有41條代謝通路在鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤組間存在顯著性差異(圖8), 尤其是在新陳代謝(metabolism)方面, 包括谷胱甘肽代謝(glutathione metabolism)、參與光合作用的蛋白質(photosynthesis proteins)、光合作用(photosynthesis)、藥物代謝細胞色素P450(drug metabolism cytochrome P450)、細胞色素P450的異生素代謝(metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)、氯代環(huán)己烷和氯苯的降解(chlorocyclohexane and chlorobenzene degradation)。鹽地堿蓬根際土壤微生物代謝通路的豐度值均高于裸地土壤微生物, 說明鹽地堿蓬根際土壤細菌群落代謝功能潛力高于裸地土壤。

3 討論

3.1 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤細菌的群落結構特征

土壤微生物群落結構不僅直接影響?zhàn)B分的轉化與組成, 也是維持和恢復土壤生產(chǎn)力的主要因素之一。土壤細菌是生態(tài)系統(tǒng)中微生物區(qū)系的主要組成成分, 微生物區(qū)系的演變(數(shù)量和組成結構)是反映土壤環(huán)境質量變化的重要生物指標[18-19]。本研究采用高通量測序技術, 對濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤和裸地土壤進行了細菌多樣性分析, 共獲得41門、100綱、282目、400科、892屬、1 577種, 鹽地堿蓬根際土壤細菌群落主要由放線菌門、綠彎菌門、藍藻細菌門、芽單胞菌門、變形菌門等組成, 優(yōu)勢群落為放線菌;裸地土壤中優(yōu)勢群落為變形菌。杜瀅鑫等[20]也發(fā)現(xiàn)變形菌門是鹽堿土中最常見的微生物類群。藍藻細菌門、酸桿菌門、甲型變形桿菌綱、產(chǎn)氧光合細菌綱、綠彎菌綱、根瘤菌目、念珠藻目、鞘脂單胞菌(從目到科)、芽孢桿菌屬是裸地土壤中沒有的。這說明鹽地堿蓬增加了土壤細菌群落的豐富性。鹽地堿蓬根際土壤和裸地土壤細菌多樣性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明, 鹽地堿蓬改變了土壤細菌群落的結構組成, 其多樣性高于裸地土壤(表3、圖7), 這是因為細菌適合生長在養(yǎng)分富足的土壤環(huán)境中, 較高的土壤肥力能夠刺激細菌的生長[21]。根據(jù)土壤理化性質分析(表2), 鹽地堿蓬的根際土壤堿解氮、速效磷、速效鉀、有機質含量較高, 鹽分比較低, 能為土壤中的細菌提供較多的營養(yǎng)[22]。此外, 有研究表明鹽地堿蓬可以改善土壤結構外, 還通過殘根、凋落物向土壤中輸入較多的碳氮源供微生物利用, 增加微生物的數(shù)量, 提高土壤酶活性。因此鹽地堿蓬對根際微生物細菌群落多樣性產(chǎn)生積極的影響[23]。深入了解環(huán)渤海濱海鹽堿地有植物與無植物土壤微生物群落的消長態(tài)勢, 對鹽堿地植被修復有重要意義。

圖6 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤(J)與裸地土壤(D)的系統(tǒng)發(fā)生進化關系

圖7 濱海鹽堿地土壤細菌目類水平群落與環(huán)境因子的相關分析

軸和軸分別為環(huán)境因子和物種, 通過計算獲得相關性值和值。值在圖中以不同顏色展示, 右側圖例是不同值的顏色區(qū)間;值則用*標出, * 0.01<≤0.05, ** 0.001<≤0.01, ***≤0.001。The-axis and-axis are environmental factors and species respectively. The correlationvalue andvalue are obtained by calculation.values are shown in different colors, and the legend on the right is the color range of differentvalues.values are marked with * for 0.01<≤0.05, ** for 0.001<≤0.01, *** for≤0.001.

3.2 濱海鹽堿地的環(huán)境因子對土壤細菌群落結構的影響

有研究者認為植被類型、土壤理化性質、緯度梯度、土壤溫度或氣候變化可以影響土壤微生物群落結構[24-27]。本研究通過相關性Heatmap分析, 分析了土壤細菌群落結構與環(huán)境因子間的相互關系, 研究表明, EC、速效鉀、堿解氮、速效磷是引起濱海鹽堿地土壤細菌群落結構差異的主要環(huán)境因子。而pH不是主要影響因素, 這與其他研究結果不一致[28],原因可能為鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤的pH相差不大, 或者是環(huán)渤海鹽堿地土壤以氯化鈉為主, 鹽含量大, 堿性小, 因此pH對植物的生長影響不大。PCoA分析(圖4)表明鹽地堿蓬的覆蓋可以解釋樣本間微生物群落結構組成不同的原因, 并且與蘆葦()[19]、甘草()[20]等植物根際土壤的優(yōu)勢菌為變形菌有一些區(qū)別, 說明不同植物的覆蓋能影響根際土壤的細菌群落結構組成及其比例。結合LEfSe分析發(fā)現(xiàn), 裸地土壤富集的細菌群落與Heatmap圖中與EC呈顯著正相關的群落一樣, 說明外硫螺菌目、巴紐爾斯菌目可以在土壤肥力貧瘠、鹽分高、結構黏滯的裸地土壤生存, 表明鹽堿環(huán)境為這些細菌提供了特異性的生存環(huán)境。有學者也在鹽場[29]和海洋[30]]中發(fā)現(xiàn)了巴紐爾斯菌目, 那么我們可以大膽假設通過培養(yǎng)此類菌群, 接種到植物根際, 提高土壤中的微生物數(shù)量和多樣性, 而微生物又能夠釋放土壤酶, 催化氧化還原、有機質礦化、腐殖物質在土壤中的合成、以及生長活性物的釋放等多種生物化學反應[31], 從而改善植物的生長環(huán)境。因此了解微生物的適應環(huán)境, 有助于挖掘和利用微生物資源。

圖8 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤(J)與裸地土壤(D)的PICRUSt功能預測

3.3 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤細菌功能預測

土壤微生物群落是土壤生態(tài)功能的基礎, 通過參與土壤有機質分解和礦化等過程影響著土壤養(yǎng)分的循環(huán)并調節(jié)和指示土壤功能[32]。采用PICRUSt方法對菌群代謝功能預測, 濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤與裸地土壤在3個水平的代謝通路是相似的, 但其中有40個功能兩者差異顯著, 并且在生物代謝通路上的豐度值高于裸地土壤。在新陳代謝通路方面, 鹽地堿蓬根際土壤細菌谷胱甘肽代謝、參與光合作用的蛋白質、光合作用、氯代環(huán)己烷和氯苯的降解等表現(xiàn)突出, 說明鹽地堿蓬的覆蓋提高了細菌群落的代謝通路途徑, 這與三七()和芒草(spp.)根際細菌功能研究結果一致[33-34]。結合Circos圖結果, 鹽地堿蓬根際土壤中的優(yōu)勢群落放線菌門的主要功能是吸收營養(yǎng)物質及作為70%抗生素的來源; 綠彎菌門能夠分解纖維素; 酸桿菌門能夠降解植物殘體多聚物及光合作用; 厚壁菌門可以產(chǎn)生芽孢抵御外界的有害因子, 具有極強的抗逆性[35]; 藍藻細菌門能夠進行產(chǎn)氧的光合作用, 還可以通過光合作用釋放特異的蛋白質信號分子來調控植物的生長和發(fā)育[36]; 浮霉菌門參與了碳氮循環(huán), 是一類具有重要生態(tài)作用的環(huán)境微生物。系統(tǒng)發(fā)生進化樹目水平下, 豐度前20的群落共屬于8個門, 均是鹽地堿蓬根際土壤中的優(yōu)勢菌門。說明鹽地堿蓬根際土壤中存在很多功能微生物, 也驗證了鹽地堿蓬在鹽堿地生物改良中的重要作用。

綜上所述, 通過Illumina Misep高通量測序分析,研究了環(huán)渤海濱海鹽堿地鹽地堿蓬根際土壤細菌群落結構組成及其功能。結果表明, 鹽地堿蓬的覆蓋改變了土壤微生物群落結構, 增加了土壤微生物群落多樣性和功能。此外, 微生物群落的變化主要是由植物、速效氮、速效鉀、速效磷、EC的變化引起的。表明鹽地堿蓬通過改善土壤質量, 為微生物提供良好的生存環(huán)境, 增加了微生物的種類和數(shù)量, 提高了根際土壤細菌群落多樣性, 增強了代謝產(chǎn)物的釋放, 促進了土壤碳、氮、硫的轉化及光合作用, 鹽地堿蓬與微生物循環(huán)反復作用, 最終達到良好的生物改良鹽堿地的效果。本研究結果為了解鹽生植物對環(huán)渤海濱海鹽堿地土壤微生物群落的影響邁出了重要的一步。目前, 我們正計劃對環(huán)渤海濱海鹽堿地生態(tài)系統(tǒng)中鹽生植物與土壤微生物群落的相互作用進行更全面的研究, 為環(huán)渤海濱海鹽堿地的改良與利用提出更準確的建議。

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The bacterial community structure and function ofrhizosphere soil*

SUN Jianping, LIU Yahui**, ZUO Yongmei, HAN Minli, ZHANG Hongwei, LYU Jingjing

(Institute of Coastal Agricultural, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Saline and Alkali Land Greening Engineering Technology Center of Heibei Province / Tangshan Key Laboratory of Plant Salt Tolerance Research, Tangshan 063299, China)

is an ideal agent for the biological enrichment of saline-alkali soil. Microorganisms in the rhizosphere of this plant play an essential role in soil improvement. The Illumina Misep high-throughput sequencing platform was used to explore the structural composition and function of the bacterial community in the rhizosphere soil ofand bare soil from coastal saline-alkali land in the Bohai Bay Rim area of Hebei, Shandong, and Tianjin, China. In total, 734 792 effective sequences were obtained from 16 samples, of which 4 285 OUTs belonged to 41 phyla, 100 classes, 282 orders, 400 families, 892 genera, and 1 577 species. The bacterial community in the rhizosphere soil ofcontained Proteobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Bacteroidetes, Gemmatimonadetes, Acidobacteria, Firmicutes, Cyanobacteria, Patescibacteria, and Planctomycetes. These results were consistent with the Alpha diversity analysis results, indicating that the community was highly diversified and significantly different from that of the bare soil. The LEfSe (LDA Effect Size) analysis showed that indicator species differentially occurred inand bare soils. Insoil, Cyanobacteria, Acidobacteria, Alphaproteobacteria, Oxyphotobacteria, Chloroflexi, Rhizobiales, Nostocales, Sphingomonadales, Sphingomonadaceae, and Bacillus were the indicator species. Based on principal coordinates analyses and a correlation heatmap, the main factors affecting the soil bacterial community at order level were the presence of, alkali-hydrolyzable nitrogen, available potassium, available phosphorus, and electrical conductivity. Also, Ectothiorhodospira and Balneolaceae could survive in bare soil with poor fertility, high salinity, and a viscous structure. PICRUSt (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States) analysis showed that 304 metabolic pathways at pathway level 3 were active in both soil, of which 41 pathways, especially those involving in metabolism were different betweensoil and bare land soil. These results indicated thatgrowth has a positive effect on the diversity and function of soil bacterial community by improving soil structure and increasing nutrients levels. These findings may be applied to improve saline-alkali land, optimize soil environment, and enhance its usefulness and sustainability.

High-throughput sequencing; Coastal saline-alkali land;; Rhizosphere soil; Bacterial community structure; Bacterial community function

S154.36

10.13930/j.cnki.cjea.200160

孫建平, 劉雅輝, 左永梅, 韓民利, 張虹偉, 呂晶晶. 鹽地堿蓬根際土壤細菌群落結構及其功能[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報(中英文), 2020, 28(10): 1618-1629

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* 河北省農(nóng)林科學院基本業(yè)務費(201810101)和河北省農(nóng)林科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目(2019-1-6-2)資助

劉雅輝, 主要研究方向為鹽堿地改良與農(nóng)業(yè)高效利用。E-mail: bhslyh@126.com

孫建平, 主要研究方向為濱海鹽堿地改良與農(nóng)業(yè)高效利用。E-mail: bhssjp@163.com

2020-03-04

2020-05-29

* This study was supported by the Basic Business Expenses of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences (201810101), the Agriculture Science and Technology Innovation Project of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences (2019-1-6-2).

, E-mail: bhslyh@126.com

Mar. 4, 2020;

May 29, 2020