廖楊文科 崔榮榮 魏子涵 陳 穎

(南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心/南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

鹽漬土含高濃度可溶性鹽(主要是NaCl)，導(dǎo)致生長(zhǎng)在其中的植物水分補(bǔ)給障礙，成為限制全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一大難題[1]。為提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率和土壤利用率，研究植物的耐鹽機(jī)制以及廣泛種植耐鹽品種，對(duì)于農(nóng)林業(yè)十分有必要。

植物在與鹽脅迫環(huán)境的長(zhǎng)期互作中，進(jìn)化出一套包含多種方式和不同層次的響應(yīng)機(jī)制。鹽漬土?xí)l(fā)植物細(xì)胞離子失衡、吸水障礙，使植物細(xì)胞能快速合成小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如糖類(蔗糖、棉子糖、水蘇糖、甘露糖等)、氨基酸(脯氨酸、甘氨酸等)及其衍生物(甜菜堿等)[2-3]，以維持低水勢(shì)和水分平衡。鹽脅迫造成的活性氧堆積，激發(fā)植物細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)，包括抗氧化酶系統(tǒng)(超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶等)[4-5]和非酶系統(tǒng)(還原型谷胱甘肽、抗壞血酸、類黃酮、類胡蘿卜素等)[6-7]。前人研究證實(shí)鹽脅迫下植物呼吸作用各階段相互整合協(xié)作，在碳代謝、產(chǎn)能、組織生長(zhǎng)、離子外排、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成、清除活性氧等方面的脅迫響應(yīng)中有重要作用[8]。而植物激素，如脫落酸[9]、乙烯[10]、多胺[11]、油菜素甾醇類[12]等，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(如受體激活、抑制子降解、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等)互作參與調(diào)控植物耐鹽性。此外還有一些參與植物耐鹽響應(yīng)多條途徑的信號(hào)物質(zhì)，如NO[13]、褪黑素[14]、H2S[15]等。然而，物種間耐鹽機(jī)制的差異，不同耐鹽響應(yīng)信號(hào)的互作方式，目前尚不清楚。

近年來，楊樹(PopulusL.)作為一種擁有高生物量的速生樹種，因其遺傳多樣性、分布廣泛性以及分子生物學(xué)手段的可適性，被確立為樹木研究的模式植物[16-17]。大部分關(guān)于楊樹耐鹽機(jī)制的研究集中在起源于我國(guó)西北鹽漬區(qū)的具有極強(qiáng)耐鹽性的胡楊(Populus euphratica)上[18]。美洲黑楊(P. deltoids)及其雜交后代是我國(guó)長(zhǎng)江中下游主要造林樹種，尤其是江蘇和湖北兩省。但江蘇北部沿海土壤鹽漬化成為限制南方楊樹栽培發(fā)展的重要問題[19]。因此，美洲黑楊及其后代的耐鹽性及鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制應(yīng)得到足夠重視。

代謝組學(xué)是一項(xiàng)頗具前景的新興方法學(xué)[20]。代謝產(chǎn)物是細(xì)胞調(diào)控過程的終產(chǎn)物，其水平可被視作機(jī)體對(duì)遺傳或環(huán)境變化的最終響應(yīng)結(jié)果[21]。該方法能反映機(jī)體與環(huán)境的互作情況，且能檢測(cè)到更多代謝水平的直接變化。目前已有大量研究涉及到眾多物種對(duì)鹽脅迫的代謝響應(yīng)，包括大麥 (Hordeum spontaneum)[22-23]、大 豆(Glycine soja)[24-25]、棉花(Gossypium hirsutum)[26]，以及楊屬(Populus)的個(gè)別種[27]。代謝組學(xué)研究的分析手段包括核磁共振譜(nuclear paramagnetic resonance，NMR)、氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜 (liquid chromatography-mass spectrography，LC-MS)等技術(shù)。其中，超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography coupled with tandemquadrupole time-offlight mass spectrometry，UHPLC-QTOF-MS)技術(shù)具有時(shí)間短、高分辨率、高靈敏度等優(yōu)勢(shì)，常用于分析研究代謝物變化。

本研究基于UHPLC-QTOF-MS 技術(shù)的植物代謝組學(xué)方法，對(duì)鹽脅迫(100 mmol·L-1NaCl)下具有中等耐鹽性的美洲黑楊無性系后代南林895 楊[P. deltoidesBart.CV. xPopulus euramericana(Dode) Guineir CV]葉片的整體代謝物變化進(jìn)行分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)技術(shù)對(duì)差異代謝通路關(guān)鍵基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，旨在深入了解木本植物適應(yīng)鹽脅迫的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

南林895 楊無菌苗，由南林895 楊無性系苗木莖段快繁所得。

1.2 試驗(yàn)方法

供試材料的培養(yǎng)及處理參考陳穎等[28]的方法并略作改進(jìn)。取南林895 楊無菌苗1 cm 莖段于MS 固體培養(yǎng)基{含6-芐氨基嘌呤[N-(phenylmethyl)-9Hpurin - 6-amine，6-BA] 0.2 mg·L-1、萘乙酸(1-naphthylacetic acid，NAA) 0.02 mg·L-1、噻苯隆(thidiazuron，TDZ)0.002 mg·L-1和蔗糖25 g·L-1}進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件: 光照強(qiáng)度 55 μmol·m-2s-1、光周期16 h 光照/8 h 黑暗、相對(duì)濕度60%和溫度周期23℃/23℃。每個(gè)莖段可獲得15 ～16個(gè)芽，待叢生芽長(zhǎng)至2 cm 以上，剪取單芽轉(zhuǎn)入1/2 MS半固體培養(yǎng)基(含6-BA 0.2 mg·L-1、NAA 0.02 mg·L-1、TDZ 0.002 mg·L-1和蔗糖25 g·L-1、0.4%瓊脂，pH 值5.8)生長(zhǎng)成苗，期間繼代1 次。待苗高達(dá)5～6 cm 時(shí)，進(jìn)行鹽脅迫處理。

將100 mmol·L-1NaCl 加入1/2 MS 半固體培養(yǎng)基，然后120℃高壓滅菌20 min 備用。選擇生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的苗插入含上述培養(yǎng)基的組培瓶中，每瓶2棵苗，每處理10 棵苗。鹽處理后16 d，測(cè)定楊樹株高、根長(zhǎng)(主根最長(zhǎng)處)，并對(duì)其中部成熟葉及根系進(jìn)行隨機(jī)取樣，用于生理指標(biāo)測(cè)定、RNA 提取和代謝組分析。代謝組分析為6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，其他檢測(cè)為4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 膜脂過氧化程度檢測(cè)

以丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量作為指標(biāo)，測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[29]。稱取0.3 g 葉片或根凍樣，用冰浴過的3 mL 0.1%(w/v)三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)研磨，12 000×g離心20 min，保留上清液。采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)反應(yīng)測(cè)定MDA 含量:取1 mL 20%(w/v)TCA 反應(yīng)液[含0.5%(w/v)TBA]，加入1 mL 上述上清液中，沸水浴30 min后迅速冰浴終止反應(yīng)，然后12 000×g離心10 min，保留上清液并于450、532、600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值。按照公式計(jì)算MDA 含量:

MDA 含量(μmol·L-1·g-1FW)＝[6.45×(A532-A600)-0.56×A450]×3/0.3

1.4 UHPLC-QTOF-MS 分析的樣品制備及測(cè)定條件

1.4.1 樣品制備 將0.2 g 葉片凍樣置于2 mL 離心管中，加入1 000 μL 提取液(甲醇∶乙腈∶水＝2∶2∶1)和20 μL 核糖醇，渦旋后研磨4 min，45 Hz 超聲提取15 min，-20℃靜置1 h，然后于4℃、13 000 r·min-1條件下離心15 min，保留上清液。取0.4 mL 上述上清液，經(jīng)真空干燥后加入1 000 μL 提取液(乙腈∶水＝1∶1，v∶v)復(fù)溶，再于4℃、12 000 r·min-1條件下離心15 min，所得上清液稀釋10 倍后取60 μL，備檢。

1.4.2 色譜條件 UHPLC 方法參考文獻(xiàn)[30]。色譜柱為Kinetex C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，乙腈-水(50∶50，v∶v 含0.1%甲酸，A)-乙腈∶水(2∶98，v∶v 0.1%甲酸，B)為流動(dòng)相，以體積流量0.4 mL·min-1進(jìn)行梯度洗脫:0～2 min，88%B；2～4 min，88%→75%B；4～10 min，75%→70%B；10 ～15 min，70%→64%B；15 ～20 min，64%→0%B，檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量3.0 μL。

1.4.3 質(zhì)譜條件 LC-MS 方法參考文獻(xiàn)[30]并加以改進(jìn)。以氮?dú)庾鳛殪F化、錐孔氣；電噴霧電離:正離子模式＆負(fù)離子模式(ESI＋＆ ESI-)；飛行管檢測(cè)模式W型；毛細(xì)管電壓3.6 kV；錐孔電壓30 V；萃取錐孔4 V；源溫120℃；脫溶劑氣溫度300℃；反向錐孔氣流100 L·h-1； 脫溶劑氣流600 L·h-1；掃描時(shí)間1 s；掃描時(shí)間間隔0.015 s；質(zhì)荷比范圍m/z 80～1 200 Da；數(shù)據(jù)采集形式centroid；靈敏性normal；動(dòng)態(tài)范圍extended。UHPLC-QTOF-MS 平臺(tái)的電離源為電噴霧電離，有正離子模式(positive ion mode，POS) 和負(fù)離子模式(negative ion mode，NEG)2 種電離方式，檢測(cè)代謝組時(shí)結(jié)合使用提高使代謝物覆蓋率，檢測(cè)效果更好，后續(xù)對(duì)2 種模式的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行分析。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理方法參考文獻(xiàn)[30]并加以改進(jìn)。數(shù)據(jù)預(yù)處理采用UHPLC-QTOF-MS 系統(tǒng)操作軟件MassLynx V4.1 中的MarkerLynx 軟件包，該軟件包能夠自動(dòng)完成譜峰識(shí)別、濾噪等前處理程序，處理參數(shù)設(shè)置如下:時(shí)間范圍0 ～21 min；質(zhì)量范圍80 ～1 200 Da；質(zhì)量偏差0.01；最小強(qiáng)度1%；質(zhì)量窗0.02 Da；保留時(shí)間窗口0.20 min；消除噪音水平6；變化峰強(qiáng)度閾值300。最后輸出由保留時(shí)間、精確質(zhì)荷比和峰面積組成的三維矩陣。

多元統(tǒng)計(jì)分析采用SIMCA(v14.1，MKS Data Analytics Solutions，Umea，Sweden)軟件，先進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)識(shí)別數(shù)據(jù)模式，以及判定數(shù)據(jù)輪廓各組間的分離情況[31-32]。使用正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)過濾代謝物中與分類變量不相關(guān)的正交變量，并分別分析非正交變量和正交變量[33]。然后，進(jìn)行OPLS-DA 置換檢測(cè)(評(píng)估模型統(tǒng)計(jì)顯著性的重要步驟):隨機(jī)改變分類變量Y排列的順序、多次建立對(duì)應(yīng)的OPLS-DA 模型以得到R2和Q2值[34]。再將差異代謝物在KEGG pathway 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行映射，取KEGG compound ID 進(jìn)行后續(xù)分析，整理出差異代謝物映射的所有通路；綜合分析差異代謝物所在通路(包括拓?fù)浜透患治?，進(jìn)一步篩選并找到與代謝物差異相關(guān)性最高的通路，結(jié)果以氣泡圖展示[34]。最后，將受鹽脅迫影響顯著的差異代謝途徑中的關(guān)鍵差異代謝物進(jìn)行映射作圖。

1.5 RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR

總RNA 提取采用Trizol[天根生化科技(北京)有限公司] 試劑盒?？俁NA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(日本TOYOBO 公司試劑盒)后，檢測(cè)基因表達(dá)量。楊樹基因序列從Populus trichocarpaV 3.0 獲得(https:/ /phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html＃! info? alias ＝Org＿Ptrichocarpa)，引物設(shè)計(jì)如表1所示。RT-qPCR 擴(kuò)增使用ABI Step One 實(shí)時(shí)定量PCR 系統(tǒng)以及南京諾唯贊生物科技有限公司的SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，以18S 核糖體DNA(rDNA)為內(nèi)參基因，基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算參照文獻(xiàn)[35]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，并采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行方差分析，兩組間比較采用t檢測(cè)，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 南林895 楊生長(zhǎng)情況和葉片MDA 含量

與對(duì)照相比，鹽脅迫16 d 后的植株葉片輕微變黃(圖1)，株高和根長(zhǎng)分別下降18.7%和54.7%(圖2-A)。但未顯著改變楊樹葉片和根系中MDA 含量(圖2-B)，說明南林895 楊具有一定的耐鹽能力。

圖1 鹽處理16 d 對(duì)南林895 楊生長(zhǎng)表型的影響Fig.1 Effect of 16-day salt stress on the growth performance of Nanlin 895

2.2 南林895 楊響應(yīng)鹽脅迫的差異代謝物和基因表達(dá)譜分析

采用UHPLC-QTOF-MS 分析鹽處理與對(duì)照組的葉片樣品，正、負(fù)離子模式下的主成分分析(principal component analysis，PCA)均顯示對(duì)照組與鹽脅迫組在主成分(principal component，PC)[1]方向區(qū)分明顯，表明兩者的化學(xué)組成存在顯著差異，該分析技術(shù)能將不同處理區(qū)分開(圖3-A、B)。本研究使用SIMACA(V14.1，MKS Data Analytics Solutions，Umea，Sweden)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換加UV 格式化(Unit Variance Scaling)處理，結(jié)果顯示，正、負(fù)離子模式下，鹽處理和對(duì)照組樣本都可以明顯區(qū)分開。R2和Q2在正離子模式下分別為0.89 和0.83(圖3-D)，負(fù)離子模式下則分別為0.87 和0.86(圖3-C)，R2接近1，說明模型符合樣本數(shù)據(jù)真實(shí)情況。同時(shí)隨著置換保留度逐漸降低，置換的Y 變量比例增大，隨機(jī)模型的R2和Q2下降，說明原模型不存在過擬合現(xiàn)象，模式穩(wěn)健性良好(過擬合的R2和Q2基本保持不變)[31-32]。本研究主要依據(jù)OPLS-DA 模式分析的第一主成分變量投影重要度(VIP>1)，結(jié)合t檢測(cè)的P值(P＜0.05)以及碎片匹配度[取值于(0，1)，similarity>0.6]篩選差異代謝物。正、負(fù)離子模式下共鑒定出115 種差異代謝物，如表2所示(僅列出差異部分重要代謝物，共67 個(gè))。

表1 RT-qPCR 測(cè)試引物Table1 Primers used in this study for RT-qPCR tests

圖2 鹽處理16 d 對(duì)南林895 楊株高、根長(zhǎng)和丙二醛含量的影響Fig.2 Effect of 16-day salt stress on the plant height，root length，and MDA content of Nanlin 895

圖3 鹽處理下南林895 楊樹葉片化學(xué)輪廓PCA 得分圖和OPLS-DA 置換檢測(cè)圖Fig.3 PCA and orthogonal projections to latent structures-discriminate analysis (OPLS-DA) in Nanlin 895 undr salt stress

基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)Pathway 數(shù)據(jù)庫(http:/ /www.kegg.jp/kegg/pathway.html)和小分子有機(jī)物活性(PubChem)數(shù)據(jù)庫(https:/ /pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行差異代謝物分析、篩選、富集與映射。首先標(biāo)記出顯著差異代謝物，整理出對(duì)應(yīng)物種Populus trichocarpa(black cottonwood)差異代謝物映射的所有通路，并富集到KEGG pathway 數(shù)據(jù)庫。然后綜合分析差異代謝物所在通路(包括拓?fù)浜透患治?，進(jìn)一步篩選與代謝物相關(guān)性最高的通路。將差異代謝物映射至KEGG pathway 和PubChem 數(shù)據(jù)庫獲得匹配的代謝物信息，并搜索擬南芥(Arabidopsis thaliana)(thale cress)的通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，結(jié)果以氣泡圖展示(圖4)。每個(gè)氣泡代表一個(gè)代謝通路，氣泡所在橫坐標(biāo)和大小與該通路的影響因子大小呈正比；所在縱坐標(biāo)和顏色表示P值(取負(fù)自然對(duì)數(shù)，即-lnPvalue)，顏色越深P值越小，富集程度越顯著[23]。正、負(fù)離子模式下，以P＜0.001 為標(biāo)準(zhǔn)，篩出5 條受鹽脅迫強(qiáng)烈影響的代謝通路，分別是半乳糖代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，嘧啶代謝，以及黃酮和黃酮醇代謝(圖4-A、B)。

圖4 鹽處理下南林895 楊葉片中差異代謝通路拓?fù)浞治鰵馀輬DFig.4 Bubble plot of the metabolic pathway topology analysis of Nalin 895 leaves salt stress

基于圖4和表2的結(jié)果，將部分鹽脅迫調(diào)控的關(guān)鍵差異代謝物映射于篩選出的差異代謝途徑中，呈現(xiàn)于圖5。代謝物下方方框內(nèi)正值表示代謝物含量受鹽脅迫上調(diào)，負(fù)值則表示下調(diào)；方框內(nèi)數(shù)值表示差異代謝強(qiáng)度[計(jì)算公式: log2(salt/control)]，符號(hào)為正即上調(diào)表達(dá)，反之則為下調(diào)表達(dá)。直線箭頭代表無中間代謝步驟，虛線箭頭表示有未標(biāo)出的中間代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明，三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA)中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物α-酮戊二酸被上調(diào)至0.86，而蘋果酸和延胡索酸分別下調(diào)至-0.31 和-0.40，表明TCA 循環(huán)受鹽脅迫影響明顯(圖5和表2)。半乳糖代謝相關(guān)代謝產(chǎn)物顯著累積，如肌醇半乳糖苷(1.51)、棉子糖(1.82)、水蘇糖(2.35)以及蔗糖(1.04)，暗示該代謝通路因鹽脅迫而增強(qiáng)。相反地，海藻糖(-0.32)和甘露糖(-0.51)則因鹽脅迫而下降。其他糖類代謝也受鹽脅迫影響，其中顯著上調(diào)的包括支鏈淀粉(1.57)、麥芽糖(1.01)、異麥芽糖(1.54)、麥芽五糖(1.53)、1-磷酸果糖(0.69)、景天庚酮糖(0.64)以及麥芽三糖(1.36)，顯著下調(diào)的包括葡糖酸鹽(-0.75)、來蘇糖(-0.62)以及蘇糖酸鹽(-0.43)(圖4、圖5和表2)。

由圖5和表2可知，楊樹的脂類代謝受鹽脅迫顯著影響。其中，磷脂酰膽堿[phosphatidylcholine，PC(16∶0/16∶0)](0.84)積累，而3-羥基丁酸(-0.91)、順式-9-棕櫚油酸(-0.80)、亞油酸(-0.50)、甘油酸鹽(-0.84)以及甘油酸(-1.91)含量減少。天冬氨酸和谷氨酸代謝被鹽脅迫明顯抑制，體現(xiàn)在部分代謝物水平顯著下降，如天冬氨酸(-0.75)、天冬酰胺(-1.20)、谷氨酸(-1.28)、γ-氨基丁酸(aminobutyric acid，GABA)(-1.00)、焦谷氨酸(-0.70)、N-乙酰-L-谷氨酸(N-acetyl-L-glatamate，NAG)(-1.32)以及鳥氨酸(-1.85)(圖4、圖5和表2)。然而，核酸代謝受鹽脅迫抑制，體現(xiàn)在部分關(guān)鍵代謝物水平下降，如腺苷(-1.71)、鳥苷(-0.32)、尿苷(-0.49)、脫氧胞苷(-0.82)、3-甲基尿苷(-0.83)、2′-脫氧-D-核糖(-0.93) 以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide，NAD)(-0.60)(圖4)。此外，與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)代謝物細(xì)胞色素B(-0.48)含量受鹽脅迫下調(diào)。N8-乙酰亞精胺(1.75)是脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生亞精胺的衍生物，在鹽處理后表現(xiàn)為水平上升(表2)。

南林895 楊在鹽脅迫處理的葉片基因相對(duì)表達(dá)量在圖5中以橢圓圖標(biāo)映射于相關(guān)代謝途徑中，橢圓內(nèi)為基因名。無黑點(diǎn)表示上調(diào)，有黑點(diǎn)表示下調(diào)，灰色誘明度與基因表達(dá)變化倍數(shù)呈反比。結(jié)果顯示，TCA 循環(huán)相關(guān)基因kGDH E2、SDH1、FUM1 和MDH1(α-酮戊二酸脫氫酶E2 亞基、琥珀酸脫氫酶、延胡索酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶)，半乳糖代謝相關(guān)基因α-GAL1、RFS和STS(α-半乳糖苷酶，棉子糖合酶和水蘇糖合酶)，以及果糖代謝相關(guān)基因FRUCT和HXK(β-呋喃果糖苷酶和己糖激酶)均受鹽脅迫強(qiáng)烈上調(diào)。同時(shí)，谷氨酸合成相關(guān)基因GOGAT和GS2(谷氨酸合酶和谷氨酰胺合酶)鹽處理后表達(dá)顯著增強(qiáng)，而海藻糖激酶基因FUK和谷氨酸脫氫酶基因GDH表達(dá)均受鹽脅迫抑制。

2.3 南林895 楊響應(yīng)鹽脅迫下酚類差異代謝和相關(guān)基因表達(dá)分析

由圖6可知，受鹽脅迫影響含量變化的代謝物中，有三分之二為減少；如甲酰2-氨基苯甲酸(-1.84)、黃芪苷(-0.93)、芹菜素(-0.88)、牡丹酚苷(-0.63)、4-甲氧基肉桂酸(-0.47)、黃酮烷7-O-β-D-葡糖苷(-0.44)、4-羥基肉桂酸(-0.30)以及香葉木苷(地奧斯明)(-0.21)；余下三分之一差異代謝酚類(或酚類衍生物)受鹽脅迫影響上調(diào)，包括兒茶酸(1.55)、異阿魏酸(0.40)、原花青素B4 (0.95)以及間香豆酸(0.97)。此外，酚類合成關(guān)鍵基因EPSPS和PAL1(分別編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶和苯丙氨酸解氨酶)在鹽脅迫下第16 天時(shí)的相對(duì)表達(dá)量分別下降95%和85%。

表2 鹽處理相比對(duì)照組差異代謝物的變化幅度Table2 The fold changes of metabolites in shoots of poplar seedlings under control and salt stress

表2 (續(xù))

表2 (續(xù))

圖5 鹽處理后南林895 楊葉片內(nèi)差異代謝通路中關(guān)鍵代謝物映射圖Fig.5 Changes in metabolites mapped to the metabolic pathways in Nanlin 895 leaves under salt stress

圖6 鹽處理對(duì)南林895 楊葉片中差異代謝酚類含量及酚類合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響Fig.6 Fold changes of phenolic compounds and changes in expression of phenolic biosynthesis-related genes in Nanlin 895 leaves under salt stress

3 討論

植物在鹽脅迫下會(huì)遭受離子毒害和滲透壓脅迫，并產(chǎn)生一系列嚴(yán)重危害植物生長(zhǎng)發(fā)育的次生效應(yīng)[3，36]。本研究在單芽生長(zhǎng)40 d(繼代1 次)、根系和葉片均健康的植株培養(yǎng)基中加入100 mmol·L-1NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)南林895 楊株高和根長(zhǎng)均下降且葉色輕微發(fā)黃(圖1和圖2)，植株生長(zhǎng)受到明顯抑制，但葉片和根系中的MDA 含量未顯著增加(圖2)。相比根系，葉片作為經(jīng)濟(jì)器官在楊樹造林和產(chǎn)業(yè)化中具有更重要的地位，因此本研究通過代謝組學(xué)分析鹽脅迫下南林895 楊葉片代謝通路的變化，在正、負(fù)離子模式下共得到115 個(gè)差異代謝物，篩選出5 條受鹽脅迫強(qiáng)烈影響的關(guān)鍵代謝通路，將關(guān)鍵代謝物映射至代謝通路中，檢測(cè)到所篩選的代謝通路部分相關(guān)基因表達(dá)量受鹽脅迫影響顯著。南林895 楊植株可通過調(diào)控體內(nèi)代謝建立耐鹽機(jī)制，降低膜脂過氧化水平，達(dá)到抵御鹽脅迫的目的。

3.1 南林895 楊葉片呼吸作用及核酸代謝對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)

植物對(duì)鹽脅迫適應(yīng)性是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程。目前對(duì)植物耐鹽機(jī)制的理解，包括滲透壓調(diào)節(jié)、離子運(yùn)輸和平衡、能量轉(zhuǎn)換、碳氮代謝及抗氧化等，但具體細(xì)節(jié)仍不清楚。本研究中，鹽脅迫導(dǎo)致南林895 楊葉片TCA 循環(huán)中關(guān)鍵基因SDH1、FUM1、和MDH1 均有顯著上調(diào)表達(dá)，重要中間產(chǎn)物蘋果酸和延胡索酸含量下降(圖5和表2)，這與前人在部分耐鹽能力弱的大豆品種中的研究結(jié)果類似[24-25]。而南林895 楊具有一定耐鹽能力，這種不一致可能歸因于草本植物和木本植物的差異，或植物年齡、研究對(duì)象的環(huán)境條件，甚至其他因素(如鹽脅迫濃度、取樣時(shí)間等)?；贛DH1 表達(dá)增加和蘋果酸含量減少(圖5和表2)，推測(cè)草酰乙酸迅速再生，促進(jìn)TCA 循環(huán)加快和檸檬酸氧化脫羧，導(dǎo)致代謝向積累α-酮戊二酸的方向進(jìn)行。相應(yīng)地，α-酮戊二酸含量增加、α-酮戊二酸脫氫酶E2亞基的編碼基因kGDHE2 表達(dá)增強(qiáng)，可能是同化物消耗加劇的信號(hào)。Jacoby 等[8]強(qiáng)調(diào)線粒體為植物新組織和器官生長(zhǎng)發(fā)育提供足量的ATP，在植物耐鹽中有重要作用。但本研究中鹽脅迫下南林895 楊葉片植株生長(zhǎng)卻減緩，推測(cè)TCA 循環(huán)加快導(dǎo)致同化物氧化分解，可能并未將產(chǎn)生的ATP 提供給新組織和器官，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)受抑制[37]。與此同時(shí)，本研究還觀察到核酸代謝明顯減慢、細(xì)胞分裂素B 含量增加(圖5和表2)，這與前人報(bào)道的結(jié)果一致[38]。轉(zhuǎn)運(yùn)RNA 是細(xì)胞分裂素合成前體[39]，因此細(xì)胞分裂素水平的降低可能歸因于衰退的核酸代謝強(qiáng)度[40]，這也可能是楊樹植株生長(zhǎng)速率減緩的原因[41]。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫抑制南林895 楊生長(zhǎng)，很可能與TCA 循環(huán)加速和同化物分解加快，以及生長(zhǎng)相關(guān)的核酸和植物激素等含量減少有關(guān)。

3.2 南林895 楊葉片脂類和半乳糖代謝對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)

鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過氧化[42]，常以MDA 作為檢測(cè)指標(biāo)[43]。本研究中，鹽脅迫并未顯著增加南林895 楊葉片和根系的MDA 含量(圖2)，暗示鹽脅迫未對(duì)楊樹細(xì)胞質(zhì)膜造成嚴(yán)重傷害，這與前人在耐鹽型埃及大麥中的報(bào)道一致[44]。磷脂酰膽堿(phosphatidyl cholines，PC)不僅是生物膜的結(jié)構(gòu)單元，而且在生物膜適應(yīng)脅迫中扮演著重要角色[45]。代謝組分析結(jié)果顯示，鹽脅迫導(dǎo)致楊樹葉片PC 顯著積累(圖5和表2)。在玉米根系遭受鋁脅迫后，PC 含量增加3 倍左右，但脂類總量減少49%[46]。極性膽堿構(gòu)成的PC 頭部對(duì)脅迫條件下維持生物膜的穩(wěn)定性至關(guān)重要[47]。因此，鹽脅迫下PC 含量增加可能是植物細(xì)胞響應(yīng)逆境、限制MDA 堆積的適應(yīng)性反應(yīng)。此外，研究發(fā)現(xiàn)鹽害和冷害導(dǎo)致擬南芥的PC 含量增加，推測(cè)PC 還可能參與細(xì)胞膜介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[48-49]。

本研究差異代謝物拓?fù)浞治鲲@示，半乳糖代謝在南林895 楊耐鹽響應(yīng)機(jī)制中有重要作用(圖4)。半乳糖基化的蔗糖分子稱為棉子糖族寡糖(raffinose family oligosaccharides，RFOs)。本研究中，鹽脅迫下楊樹葉片中RFOs(包括棉子糖、水蘇糖和肌醇半乳糖苷)含量增加，與前人研究結(jié)果相似[50-52]。相應(yīng)的，RFOs 代謝關(guān)鍵基因RFS、STS和α-GAL1 也被鹽脅迫強(qiáng)烈上調(diào)表達(dá)(圖5)。這些結(jié)果表示鹽處理導(dǎo)致RFOs 代謝強(qiáng)度爆發(fā)。RFO 能參與滲透調(diào)節(jié)和清除氧自由基[51，53-55]幫助植物抵御環(huán)境脅迫造成的傷害。因此，鹽脅迫誘導(dǎo)半乳糖合酶催化RFOs 合成與堆積[56-57]，提高楊樹細(xì)胞的滲透壓適應(yīng)性和抗氧化能力，從而限制MDA 含量的上升[50，54，57]。鹽處理導(dǎo)致葉片中蔗糖增加可能為RFOs 合成提供原料[58]。同時(shí)，本研究中其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(海藻糖、來蘇糖、甘露糖)含量減少，且FUK基因下調(diào)表達(dá)(圖5)，這些結(jié)果表明南林895 楊可能主要通過積累RFOs 進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)和抗氧化，以響應(yīng)鹽脅迫。此外，本研究中鹽處理導(dǎo)致葉片中麥芽糖、異麥芽糖、麥芽三糖和麥芽五糖含量增加的同時(shí)，伴隨果糖代謝相關(guān)基因FRUCT和HXK表達(dá)上調(diào)，可能與脅迫引起總糖含量上升有關(guān)[59-60]。

3.3 南林895 楊葉片氨基酸代謝對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)

游離氨基酸不僅是蛋白質(zhì)合成單元，而且在植物抵抗環(huán)境脅迫中發(fā)揮重要作用[61]。大部分氨基酸相關(guān)代謝物均受鹽脅迫影響含量下降(圖5和表2)，與前人研究相似[25]。此外，差異代謝物拓?fù)浞治鲲@示天冬氨酸和谷氨酸代謝在南林895 楊耐鹽機(jī)制中有重要作用(圖4)。谷氨酸合成主要基因GOGAT和GS2 受鹽處理誘導(dǎo)表達(dá)顯著上調(diào)，而催化谷氨酸合成支路的GDH被鹽脅迫抑制表達(dá)，谷氨酸、焦谷氨酸、N-乙酰-L-谷氨酸和GABA 等含量均下降。同時(shí)，鳥氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺含量也減少(圖5)。研究表明，棘孢曲霉侵染黑麥草，能導(dǎo)致植物體內(nèi)丙氨酸、脯氨酸、GABA 以及天冬氨酸含量減少，進(jìn)而耐鹽能力增強(qiáng)[62]，與本研究結(jié)果相似。谷氨酸代謝削弱會(huì)切斷脯氨酸和GABA 的合成來源。包括亞精胺在內(nèi)的多胺能通過減少Na＋吸收、改善營(yíng)養(yǎng)平衡、抵抗氧化脅迫，以及甲基乙二醛解毒等多種方式提高植物對(duì)抗鹽脅迫的能力[11]。而多胺與脯氨酸在合成上競(jìng)爭(zhēng)前體鳥氨酸[63]。本研究中，鹽脅迫導(dǎo)致楊樹葉片中多胺衍生物N8-乙酰亞精胺堆積(圖5)，可能通過消耗大量鳥氨酸限制了脯氨酸合成。綜上，推測(cè)南林895 楊可能整合各種氨基酸代謝、形成一套較為復(fù)雜的保護(hù)機(jī)制，如降低丙氨酸、脯氨酸和GABA 合成代謝，以及刺激亞精胺相關(guān)抗性途徑增強(qiáng)等，以提高其耐鹽能力。

3.4 南林895 楊葉片酚類代謝對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)

根據(jù)差異代謝物拓?fù)浞治?圖4)，酚類中的黃酮和黃酮醇合成受鹽處理影響劇烈。酚類作為植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物，在植物遭受逆境能清除活性氧(reactive oxygen species，ROS)[64]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)南林895 楊葉片中酚類合成關(guān)鍵基因EPSPS和PAL1表達(dá)均受鹽脅迫影響顯著下調(diào)，且三分之二的差異代謝酚類含量下降(圖6和表2)。前人研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)源于鹽漬地區(qū)的胡楊具有高水平的酚類合成代謝以加強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)，是其具有極強(qiáng)耐鹽能力的原因之一[27]。南林895 楊作為美洲黑楊無性系后代，是一種廣泛適生型速生楊，其耐鹽機(jī)制可能與胡楊不同。南林895楊減少酚類合成，以便將節(jié)約下來的能量供給其他代謝途徑，如PC、RFOs 或多胺等的合成來緩解鹽害導(dǎo)致的氧化脅迫(圖5和表2)。酚類代謝物在南林895 楊鹽脅迫響應(yīng)中的作用仍需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在鹽脅迫下，南林895 楊無菌培養(yǎng)植株的TCA 循環(huán)速率增強(qiáng)，PC、RFOs 和氨基酸合成和抗氧化系統(tǒng)等生理響應(yīng)會(huì)導(dǎo)致植株生長(zhǎng)速率減緩。本研究結(jié)果為從代謝組水平揭示中等耐鹽的美洲黑楊無性系后代南林895 楊響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制提供了證據(jù)。