譚光輝, 李杰章, 覃媛鈺, 吳 磊, 張依裕

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院；2.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

眾所周知，優(yōu)質(zhì)的蛋殼不僅能降低蛋的破損率，而且能有效防止病菌等微生物侵入蛋內(nèi)，保障蛋制品的安全；此外，蛋殼還能調(diào)節(jié)代謝氣體和水的交換，并為胚胎提供鈣[1].據(jù)估計(jì)，將蛋殼平均強(qiáng)度提高1 N，每只母雞每下一個(gè)周期的破蛋率將減少0.5%[2].可見，提高蛋殼品質(zhì)對(duì)于減少蛋殼破損帶來的經(jīng)濟(jì)損失、增強(qiáng)食品安全以及保證胚胎的正常發(fā)育有著重要意義.蛋殼在蛋殼腺中由大量的無機(jī)物沉積形成，其中，碳酸鈣占總含量的93%，表明蛋殼品質(zhì)的優(yōu)劣與蛋殼腺中的Ca2+量有直接關(guān)系[3].鈣釋放激活鈣調(diào)節(jié)蛋白1是ORAI的家族成員之一，該基因編碼的蛋白廣泛表達(dá)于動(dòng)物各種類型的細(xì)胞中，主要定位于細(xì)胞膜上，是一種操控Ca2+進(jìn)出細(xì)胞的膜蛋白，它的關(guān)閉與打開受到細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或肌漿網(wǎng))中Ca2+濃度的嚴(yán)格調(diào)控[4-7].Dong et al[8]研究揭示，ORAI1基因能夠控制細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，Ca2+內(nèi)流通過ORAI1基因通道間歇性激活.鈣釋放酶激活鈣調(diào)器1是Ca2+通道的一個(gè)亞型，能夠調(diào)控細(xì)胞中Ca2+的濃度，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡[9-10].此外，Woo et al[11]研究表明，ORAI1基因可能是肌肉肥大中Ca2+信號(hào)改變的原因之一.Dou et al[12]在敲除小鼠ORAI1基因后，發(fā)現(xiàn)小鼠神經(jīng)細(xì)胞中Ca2+的濃度發(fā)生改變，顯著降低了有害刺激引起的急性疼痛.綜上研究表明，ORAI1基因編碼的蛋白作為調(diào)控Ca2+進(jìn)出細(xì)胞的膜蛋白，可能通過調(diào)節(jié)Ca2+流入細(xì)胞進(jìn)而影響動(dòng)物的表型現(xiàn)狀.近年來，ORAI1作為一種存在于質(zhì)膜中的高度Ca2+選擇性通道，盡管其生物功能在老鼠和人上已經(jīng)得到廣泛的研究，但在家禽上的研究甚少.本研究通過檢測(cè)鴨ORAI1基因的遺傳變異，探討其與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性，為從分子角度改善蛋殼品質(zhì)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

在貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院農(nóng)場(chǎng)中隨機(jī)選擇單體籠飼養(yǎng)、健康無病及同等管理?xiàng)l件下的45周齡三穗鴨102只，收集并記錄一周內(nèi)每只鴨產(chǎn)下的蛋(共630枚).鴨逐只靜脈采血1.0～1.5 mL用于基因組DNA的提取.

1.2 蛋殼品質(zhì)的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]的方法測(cè)定630枚鴨蛋的蛋形指數(shù)及蛋殼的厚度、強(qiáng)度、重量，收集每只鴨7 d產(chǎn)下的蛋，測(cè)定蛋殼品質(zhì)數(shù)據(jù)，求平均值.用清水洗去附著在蛋外殼的糞便，用鑷子夾去內(nèi)膜后用BL-320H型電子天平(日本島津公司)測(cè)量蛋殼重(g)；蛋的長(zhǎng)度和寬度用游標(biāo)卡尺(武漢道簡(jiǎn)貿(mào)易有限公司)測(cè)量，蛋的形狀指數(shù)為長(zhǎng)度與寬度之比(長(zhǎng)度/寬度)；采用ETG-1061型蛋殼厚度測(cè)定儀(北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司)在鈍性、赤道性和銳性區(qū)域測(cè)量不帶內(nèi)膜的蛋殼厚度(精確度0.01 mm)，取3個(gè)值的平均值為蛋殼厚度；用EFR-01型蛋殼壓力計(jì)(北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司)測(cè)定蛋殼強(qiáng)度.

1.3 ORAI1基因遺傳變異的檢測(cè)

1.3.1 血液基因DNA的提取 用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取102只三穗鴨血液基因組DNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)D260 nm和D280 nm.根據(jù)D260 nm/D280 nm預(yù)測(cè)DNA的純度，純品DNA的D260 nm/D280 nm為1.6～1.9.用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)，稀釋成最終濃度為100 ng·μL-1.

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的鴨ORAI1基因外顯子序列(NC_040061.1)，采用在線Primer 3.0程序(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)的引物(表1)交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

1.3.3 DNA池的PCR擴(kuò)增程序及測(cè)序分型 PCR反應(yīng)體系：8 μL 2×Es Taq MastermMix(北京擎科生物公司)，正、反向引物(10 pmol·L-1)各1.0 μL，1 μL DNA，用dd H2O補(bǔ)足至20 μL.PCR擴(kuò)增程序：于95 ℃預(yù)變性6 min；于94 ℃變性35 s，參考表1的溫度退火40 s，于74 ℃延伸50 s，于72 ℃終延伸6 min，共38個(gè)循環(huán).PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，具有目的條帶的送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序.測(cè)序結(jié)果采用DNAStar軟件中的MegaAlign程序初步篩選單核苷酸突變(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn).根據(jù)篩查結(jié)果選用相應(yīng)的引物，以個(gè)體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序分型.

表1 三穗鴨ORAI1基因的引物信息

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0中的一般線性模型(GLM)單因素方差分析ORAI1基因SNP基因型與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性.

2 結(jié)果與分析

2.1 三穗鴨ORAI1基因SNP位點(diǎn)的篩查與鑒定

將ORAI1基因在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的序列與PCR擴(kuò)增后測(cè)序得到的序列運(yùn)用MegaAlign程序進(jìn)行比對(duì)，查找SNP，結(jié)果如圖1所示.在三穗鴨ORAI1基因第3外顯子發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNP位點(diǎn)，分別是g.16789 C>T、g.16984 C>T和g.17074 A>G，分別位于CDS區(qū)的第186、381和471位，均產(chǎn)生3種基因型.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)SNP位點(diǎn)未引起氨基酸的改變，屬于同義突變.

2.2 三穗鴨ORAI1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的遺傳特性

三穗鴨ORAI1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)遺傳參數(shù)的分析結(jié)果(表2)顯示：g.16789 C>T、g.16984 C>T和g.17074 A>G 3個(gè)位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型分別是CC、CC和AA，其頻率分別為0.529、0.529和0.588；優(yōu)勢(shì)等位基因分別是C、C和A，其頻率分別為0.647、0.647和0.735；3個(gè)SNP位點(diǎn)均屬于中度多態(tài)(0.25T和g.16984 C>T兩個(gè)位點(diǎn)的基因型分布均顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)；g.17074 A>G 位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05).

表2 三穗鴨ORAI1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的遺傳參數(shù)1)

2.3 三穗鴨ORAI1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)連鎖不平衡分析

對(duì)三穗鴨ORAI1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析.結(jié)果(表3)顯示：g.16789 C>T位點(diǎn)與g.16984 C>T位點(diǎn)之間的D′值為1，γ2值為0.998；g.16789 C>T位點(diǎn)與g.17074 A>G位點(diǎn)之間的D′值為1，γ2值為0.196；g.16984 C>T位點(diǎn)與g.17074 A>G位點(diǎn)之間的D′值為1，γ2值為0.185.根據(jù)Ardlie et al[14]和Slatkin[15]的報(bào)道，當(dāng)|D′|>0.8，γ2>0.33時(shí)，SNP位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡，因此從本研究結(jié)果來看，3個(gè)SNP位點(diǎn)之間只有g(shù).16789 C>T位點(diǎn)與g.16984 C>T位點(diǎn)存在強(qiáng)連鎖不平衡.

表3 三穗鴨ORAI1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡D′和γ2值1)

2.4 三穗鴨ORAI1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍型和雙倍型分析

對(duì)三穗鴨ORAI1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行單倍型和雙倍型分析，結(jié)果(表4)顯示：3個(gè)SNP位點(diǎn)在三穗鴨群體中共檢測(cè)到3種單倍型和6種雙倍型，其中，優(yōu)勢(shì)單倍型是H1，頻率為0.382；劣勢(shì)單倍型是H2，頻率為0.265；優(yōu)勢(shì)雙倍型是H1H1和H3H3，頻率分別為0.335和0.235.

表4 三穗鴨ORAI1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍型和雙倍型頻率

2.5 三穗鴨ORAI1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性

三穗鴨ORAI1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)與蛋殼品質(zhì)關(guān)聯(lián)性的分析結(jié)果(表5)顯示，g.16789 C>T、g.16984 C>T和g.17074 A>G 3個(gè)位點(diǎn)均對(duì)蛋殼強(qiáng)度的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05).其中，g.16789 C>T和g.16984 C>T兩個(gè)位點(diǎn)CT雜合基因型個(gè)體的蛋殼強(qiáng)度均顯著高于TT純合基因型(P<0.05)，而g.17074 A>G位點(diǎn)GG基因型個(gè)體的蛋殼強(qiáng)度顯著高于AG基因型(P<0.05).

表5 三穗鴨ORAI1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性1)

2.6 三穗鴨ORAI1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)雙倍型與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性

三穗鴨3個(gè)SNP位點(diǎn)組合基因型與蛋殼品質(zhì)關(guān)聯(lián)性的分析結(jié)果(表6)顯示：H2H3和H3H3雙倍型個(gè)體的蛋殼厚度顯著高于H2H2型(P<0.05)；H3H3型的蛋殼強(qiáng)度顯著高于H2H2型(P<0.05)；其他雙倍型與蛋殼品質(zhì)沒有產(chǎn)生顯著差異(P>0.05).

表6 三穗鴨ORAI1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)雙倍型與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性1)

3 討論

優(yōu)質(zhì)的蛋殼不僅能降低蛋在自動(dòng)分揀包裝和運(yùn)輸?shù)冗^程中造成的物理損傷，而且能夠阻擋有害病菌入侵蛋的內(nèi)部，保障禽類胚胎的正常發(fā)育和食品安全.Onouchi et al[16]和Chang et al[17]研究表明，ORAI1作為Ca2+釋放激活通道，介導(dǎo)存儲(chǔ)操作的Ca2+進(jìn)入質(zhì)膜，位于ORAI1基因外顯子2(rs3741596)非同義單核苷酸多態(tài)性與川崎病的發(fā)生顯著相關(guān)，揭示ORAI1基因SNP影響Ca2+進(jìn)入質(zhì)膜，引起機(jī)體組織細(xì)胞中Ca2+的釋放量從而影響細(xì)胞的增殖與凋亡.Lian et al[18]研究表明，ORAI1作為一種操控Ca2+進(jìn)入細(xì)胞的膜蛋白，當(dāng)ORAI1基因發(fā)生突變，能導(dǎo)致Ca2+進(jìn)入細(xì)胞受阻，引起機(jī)體胚層發(fā)育不良和免疫缺陷.本研究在三穗鴨ORAI1基因第3外顯子共檢測(cè)到3個(gè)同義突變位點(diǎn)，可見三穗鴨ORAI1基因相對(duì)來說是比較保守的，突變位點(diǎn)較少.3個(gè)SNP位點(diǎn)除了g.17074 A>G 位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)外，另外兩個(gè)位點(diǎn)(g.16789 C>T、g.16984 C>T)的基因型分布均顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.05).Hardy-Weinberg平衡是在一個(gè)無限大的群體中，若個(gè)體之間隨機(jī)交配，沒有突變、遷移和遺傳漂變，群體內(nèi)一個(gè)位點(diǎn)上的基因型及其頻率將保持代代不變，處于遺傳平衡狀態(tài)[19].因此，g.16789 C>T和g.16984 C>T兩個(gè)位點(diǎn)可能受到突變、選擇和遺傳漂變等影響，也可能與本研究樣本量較少有關(guān)，致使兩個(gè)突變位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡.連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，g.16789 C>T位點(diǎn)與g.16984 C>T位點(diǎn)之間存在強(qiáng)連鎖不平衡，揭示這兩個(gè)SNP位點(diǎn)趨向整體遺傳.

分子標(biāo)記輔助選擇是改善畜禽機(jī)體，使其更有利于人類生產(chǎn)發(fā)展所需的一種有效而簡(jiǎn)便的重要途徑.本研究在三穗鴨3個(gè)SNP位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)3種單倍型和6種雙倍型，理論上應(yīng)該有8種單倍型和36種雙倍型，試驗(yàn)觀測(cè)到的數(shù)據(jù)與理論值之間相差8種單倍型、30種雙倍型，可能在現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖的過程中，人工的選擇培育致使其他單倍型和雙倍型個(gè)體缺失或者在三穗鴨群體中本就沒有其他單倍型和雙倍型.3個(gè)SNP位點(diǎn)與蛋殼品質(zhì)關(guān)聯(lián)性的分析結(jié)果顯示，g.16789 C>T 和g.16984 C>T位點(diǎn)對(duì)蛋殼強(qiáng)度的影響顯著(P>0.05)，其兩個(gè)位點(diǎn)CT雜合基因型個(gè)體的蛋殼強(qiáng)度顯著高于純合TT基因型，而g.17074 A>G位點(diǎn)GG基因型個(gè)體的蛋殼強(qiáng)度顯著高于AG基因型(P<0.05).蛋殼強(qiáng)度直接體現(xiàn)蛋殼的破損程度，高強(qiáng)度蛋殼在運(yùn)輸和儲(chǔ)存過程中更有利于降低物理損傷.因此，初步判斷CT和GG基因型是提高蛋殼品質(zhì)相對(duì)有利的基因型.3個(gè)SNP位點(diǎn)組合基因型對(duì)蛋殼強(qiáng)度和厚度均有不同程度的影響，H2H3和H3H3雙倍型個(gè)體的蛋殼厚度顯著高于H2H2型(P<0.05)，H3H3型的蛋殼強(qiáng)度顯著高于H2H2型(P<0.05).前人研究表明，單核苷酸的替換，不管是同義突變還是錯(cuò)義突變，均有可能導(dǎo)致mRNA的剪切效應(yīng)及剪切準(zhǔn)確性的改變，而多個(gè)位點(diǎn)之間的聯(lián)合對(duì)畜禽基因結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用更加強(qiáng)烈，它可能與該基因控制蛋殼品質(zhì)關(guān)鍵功能位點(diǎn)連鎖共同影響蛋殼鈣的沉積[20-22].因此，多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合對(duì)蛋殼品質(zhì)的調(diào)控作用更加有效，更具有說服力.H2H2和H2H3雙倍型對(duì)蛋殼厚度和強(qiáng)度的影響均達(dá)到顯著水平，在分子標(biāo)記輔助選擇培育上，H2H2和H2H3雙倍型作為標(biāo)記位點(diǎn)可能比單個(gè)位點(diǎn)更具有參考價(jià)值.本研究由于樣本量較少，致使部分雙倍型個(gè)體數(shù)較少，因此，還需增加更多的實(shí)驗(yàn)樣本，進(jìn)一步確定關(guān)聯(lián)結(jié)果；同時(shí)，應(yīng)開展三穗鴨ORAI1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)是否引起該基因構(gòu)象變化的深入研究，進(jìn)一步挖掘ORAI1基因與蛋殼品質(zhì)密切相關(guān)的單倍型，提高育種進(jìn)度.