趙志遠(yuǎn), 王元兵, 王志勤, 湯德相, 耿宇鵬, 虞泓*

(1. 云南大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院, 昆明 650091; 2. 云南大學(xué)-中國(guó)(云南)東南亞蟲(chóng)草生物資源可持續(xù)利用國(guó)際聯(lián)合研究中心, 昆明 650091)

廣義蟲(chóng)草(Cordycepssensu lato)，是肉座菌目(Hypocreales)真菌寄生在無(wú)脊椎動(dòng)物、少數(shù)真菌和黏菌等的總稱。蟲(chóng)草是重要的藥用和生物防治資源，對(duì)保健產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和農(nóng)林有害昆蟲(chóng)調(diào)節(jié)有重要作用。冬蟲(chóng)夏草(Ophiocordyceps sinensis)、蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militaris)和蟬花蟲(chóng)草(C. cicadae)等含有多種生物活性成分，如蟲(chóng)草酸、多糖、腺苷等，對(duì)抗氧化、抗腫瘤、潤(rùn)肺、提高免疫力和降血糖血脂有明顯功效，具有重要的藥用價(jià)值[1]。在生物防治研究中，球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、布氏白僵菌(B. brongniartii)等白僵菌屬物種對(duì)生態(tài)系統(tǒng)節(jié)肢動(dòng)物種群調(diào)節(jié)和穩(wěn)定有重要作用[2]。自然界中蟲(chóng)草種類繁多，我國(guó)更是具有豐富和獨(dú)特的蟲(chóng)草資源，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球已報(bào)道的蟲(chóng)草種類約有100屬800余種，其中我國(guó)約有40多屬400余種[3]。作為世界上12個(gè)生物多樣性豐富的國(guó)家之一，蟲(chóng)草資源的調(diào)查對(duì)豐富我國(guó)真菌多樣性具有重要意義[4]。前期，宋斌等[5]對(duì)滇黔桂蟲(chóng)草資源多樣性進(jìn)行了初步調(diào)查，發(fā)現(xiàn)52種蟲(chóng)草，表明中國(guó)是蟲(chóng)草的一個(gè)分布中心。唐保宏等[6]整理報(bào)道了河南省的10種蟲(chóng)草資源，并提出開(kāi)發(fā)和保護(hù)建議。彭凡等[7]報(bào)道安徽萬(wàn)佛山地區(qū)6種蟲(chóng)草資源，其中1種為中國(guó)新記錄。蟲(chóng)草的分布與地理位置、氣候和植被類型等環(huán)境因素有很大關(guān)系，因此對(duì)不同地區(qū)蟲(chóng)草進(jìn)行物種多樣性研究，可以更好地了解不同生態(tài)系統(tǒng)中蟲(chóng)草物種分布格局。目前，有關(guān)蟲(chóng)草的開(kāi)發(fā)應(yīng)用正在深入展開(kāi)，對(duì)蟲(chóng)草資源進(jìn)行廣布性調(diào)查，明確各地區(qū)蟲(chóng)草物種名錄，可以為保護(hù)與合理開(kāi)發(fā)利用蟲(chóng)草資源提供基礎(chǔ)信息，為有害昆蟲(chóng)生物防治提供理論依據(jù)。

大理白族自治州位于云南省中西部，平均海拔2 090 m，主要以山地為主，地勢(shì)西北高、東南低。全年溫差較小，四季如春，年均降雨量約1 053 mm，四季干濕分明[8]。巍山彝族回族自治縣位于大理白族自治州的西南部，地處哀牢山和無(wú)量山的北部,是瀾滄江和紅河兩大水系的分水嶺，并且具有縱貫巍山壩子的西河為國(guó)際河流——紅河的源頭。巍山地區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)氣候類型，年均溫為15.7℃, 降雨量約812.6 mm[9-10]。因其獨(dú)特的地形地貌、全年溫和的氣候條件以及茂密的天然森林植被，為該地區(qū)真菌資源的形成提供了良好的地理優(yōu)勢(shì)和生態(tài)環(huán)境，因此巍山地區(qū)勢(shì)必?fù)碛胸S富的蟲(chóng)草物種多樣性。

本研究于2019年7-9月分別在巍山地區(qū)東、西、南、北和中部設(shè)置樣地進(jìn)行蟲(chóng)草的資源調(diào)查,通過(guò)形態(tài)觀察及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定物種,采用α多樣性和物種相對(duì)頻率分析探討該地區(qū)蟲(chóng)草物種多樣性，基于物種累計(jì)曲線預(yù)測(cè)巍山地區(qū)蟲(chóng)草豐富度，以期了解該地區(qū)蟲(chóng)草物種多樣性和分布特點(diǎn), 為蟲(chóng)草資源的保護(hù)和可持續(xù)利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

巍山彝族回族自治縣位于云南省西部，地處99°55′~100°25′ E，24°56′~25°32′ N。全縣面積2 183.01 km2，山地面積占全縣的94%，具有豐富的森林植被資源。巍山地區(qū)森林多為天然林，以針葉林和針闊混交林為主，多為云南松(Pinus yunnanensis)和櫟樹(shù)(Quercus linn)、冬瓜樹(shù)(Alnus cremastogyne)、核桃(Juglans regia)、高山榕(Ficus altissima)和華山松(Pinus armandii)組成[11]。

1.2 方法

標(biāo)本采集2019年7-9月分別在巍山地區(qū)東、西、南、北和中部的巍寶山、紫金山、小雞足山、紅河源和衛(wèi)東林場(chǎng)采集蟲(chóng)草標(biāo)本。蟲(chóng)草通常生長(zhǎng)在林中灌木叢下、枯枝落葉層或樹(shù)葉背面等環(huán)境濕度較高的地方，采用沿路踏查、普查等方式，在適宜蟲(chóng)草生長(zhǎng)的小生境下采集。采集的標(biāo)本用脫脂棉包好，放入滅菌的收集管和密封袋保鮮，于4℃冰箱內(nèi)保存。

菌株分離參見(jiàn)梁宗琦等[12]和王元兵等[13]的方法，采取子囊孢子分離法、組織分離法和表面消毒法進(jìn)行菌種分離。所有蟲(chóng)草標(biāo)本均保存在云百草標(biāo)本館(YHH)，純化分離菌株均保存于云南真菌培養(yǎng)物保存中心(YFCC)。

物種培養(yǎng)和鑒定使用PDA培養(yǎng)基在25℃下培養(yǎng)蟲(chóng)草，采取形態(tài)觀察和多基因(nrSSU、nrLSU、EF-1α、RPB1和RPB2)系統(tǒng)發(fā)育分析的方法[14-15],鑒定采集物種。形態(tài)觀察包括寄主的種類、有性型和無(wú)性型等特征。采用CTAB法提取成熟菌絲的總DNA對(duì)5個(gè)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，用1%瓊脂糖膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，將條帶明亮且無(wú)雜帶的樣品送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)已有研究[16-20]，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并下載蟲(chóng)草的5個(gè)基因序列，對(duì)單個(gè)基因數(shù)據(jù)矩陣序列進(jìn)行比對(duì)，N表示缺失的片段，最后將5個(gè)基因數(shù)據(jù)矩陣序列進(jìn)行拼接整合，以Trichoderma deliquescens和T. deliquescens作為外類群，用RAxML軟件進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析, 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(最大似然樹(shù)),確定各物種的分類地位，最后選取每種物種的代表性菌株顯示在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上。

物種多樣性分析基于α多樣性分析研究樣地內(nèi)蟲(chóng)草真菌數(shù)量特征，物種豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)，用RStudio的Vegan軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[21-23]。相對(duì)頻率(relative frequency, RF)指巍山地區(qū)采集的某種蟲(chóng)草物種數(shù)占該地區(qū)蟲(chóng)草總數(shù)的百分比。相似性系數(shù)(similarity coefficient, Cs)采用Sorenson公式計(jì)算：Cs=2j/(a+b)，式中，j指兩樣地間共有的蟲(chóng)草物種數(shù)，a指一個(gè)樣地的蟲(chóng)草物種數(shù)，b指另一樣地的蟲(chóng)草物種數(shù)目[24]。利用EstimateS軟件計(jì)算和分析ACE指數(shù)和Bootstrap指數(shù)，以獲得物種期望豐富度(S)。通過(guò)Excel繪制巍山地區(qū)蟲(chóng)草的物種累計(jì)曲線(species accumulation curve)。

2 結(jié)果和分析

2.1 蟲(chóng)草物種鑒定

本次調(diào)查共采集蟲(chóng)草341株，初步鑒定巍山地區(qū)有20種蟲(chóng)草，隸屬于2科5屬，分別是蟲(chóng)草科(Cordycipitaceae)的蟲(chóng)草屬(Cordyceps)、白僵菌屬、Samsoniella和線蟲(chóng)草科(Ophiocordycipitaceae)的線蟲(chóng)草屬(Ophiocordyceps)和多頭霉屬(Polycephalomyces)。其中有7種為疑似新物種，隸屬于2科4屬, 其中，2種蟲(chóng)草屬、2種Samsoniella、1種多頭霉屬和2種線蟲(chóng)草屬(表1, 圖1)。

表1 巍山地區(qū)調(diào)查樣地信息Table 1 Investigate plots in Weishan County

2.2 蟲(chóng)草分布特征

巍山地區(qū)采集到341株蟲(chóng)草，分別鑒定為13種已知種和7種疑似新物種，其中巍寶山9種(73株)，占該地區(qū)總數(shù)的21.4%；紫金山8種(53株), 占15.5%；小雞足山9種(25株)，占7.3%；紅河源13種(125株)，占36.7%；衛(wèi)東林場(chǎng)8種(61株)，占17.9%。只有細(xì)腳蟲(chóng)草(C. tenuipes)和球孢白僵菌在5個(gè)樣地均有分布?；谖锓N豐富度指數(shù)、Berger-Parker 優(yōu)勢(shì)度、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)分析巍山地區(qū)東、西、南、北和中部5個(gè)樣地的蟲(chóng)草物種多樣性表明，該地區(qū)蟲(chóng)草物種多樣性較高，優(yōu)勢(shì)種屬現(xiàn)象較為明顯，優(yōu)勢(shì)屬為蟲(chóng)草屬(優(yōu)勢(shì)度為0.63，共采集215株)，優(yōu)勢(shì)種為蛹蟲(chóng)草(生態(tài)優(yōu)勢(shì)度為0.27，共采集了93株)，蟲(chóng)草寄主涉及鱗翅目、鞘翅目、膜翅目和半翅目昆蟲(chóng)，主要是鱗翅目。對(duì)各樣地蟲(chóng)草物種多樣性的分析表明,北部的紅河源樣地蟲(chóng)草物種多樣性較高(Shannonwiener指數(shù)為1.76，物種豐富度為13種)，多樣性最低的是南部的小雞足山(Shannon-wiener指數(shù)為1.60，物種豐富度為9種)。

用物種相似性系數(shù)(Cs)來(lái)比較巍山地區(qū)不同樣地間的蟲(chóng)草物種組成的相似度。從表3可見(jiàn)，巍山地區(qū)5個(gè)樣地中，紅河源樣地與其他樣地的相似度最高，為0.38~0.64；巍寶山樣地與紅河源樣地的物種相似度最高，Cs達(dá)0.64；小雞足山與紫金山樣地、巍寶山與衛(wèi)東林場(chǎng)樣地的蟲(chóng)草物種組成最為接近, Cs為0.58；而小雞足山與衛(wèi)東林場(chǎng)樣地的Cs最低，為0.24。

2.3 蟲(chóng)草物種累計(jì)曲線

物種累計(jì)曲線是描述隨抽樣數(shù)量增多而增加物種數(shù)量的模型，是調(diào)查研究樣地物種組成和預(yù)測(cè)物種豐度的理想工具[25]。本研究基于巍山東、西、南、北和中部5個(gè)研究樣地蟲(chóng)草的物種分布數(shù)據(jù)，利用EstimateS軟件計(jì)算和分析了巍山地區(qū)蟲(chóng)草多樣性,繪制了巍山蟲(chóng)草物種累計(jì)曲線。

根據(jù)物種累計(jì)曲線圖和EstimateS軟件計(jì)算,ACE值和Bootstrap值分別為21.16和22.72，表明該地區(qū)蟲(chóng)草豐富度約為21~23種，估計(jì)本次研究已經(jīng)調(diào)查了巍山地區(qū)86.96%~95.24%的蟲(chóng)草。

3 結(jié)論和討論

圖1 基于5個(gè)基因(nrSSU、 nrLSU、EF-1α、RPB1和RPB2)構(gòu)建的巍山地區(qū)蟲(chóng)草系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。*: 采自巍山地區(qū)。Fig. 1 Phylogenetic tree of Cordyceps sensu lato from the Weishan country constructed by the analysis of five-locus (nrSSU, nrLSU, EF-1α, RPB1 and RPB2)dataset. *: Collected from Weishan area.

表2 蟲(chóng)草標(biāo)本統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of Cordyceps sensu lato specimens

表3 巍山地區(qū)的蟲(chóng)草物種多樣性指數(shù)Table 3 Diversity indexes of Cordyceps sensu lato in Weishan County

圖2 巍山地區(qū)的蟲(chóng)草物種累計(jì)曲線Fig. 2 Species accumulation curve of Cordyceps sensu lato in Weishan County

本研究結(jié)果表明，巍山地區(qū)擁有豐富且獨(dú)特的蟲(chóng)草資源，其蟲(chóng)草物種多樣性較高，物種豐富度較大。本次調(diào)查的采樣范圍涉及巍山地區(qū)的東、南、西、北和中部5個(gè)樣地，包括未被人類活動(dòng)干擾的樣地以及已被開(kāi)發(fā)的自然保護(hù)區(qū)樣地，以期更詳細(xì)探明巍山地區(qū)蟲(chóng)草的數(shù)量及種類。本次調(diào)查共采集蟲(chóng)草341株，鑒定出20種蟲(chóng)草，其中有7種疑似新物種，分別隸屬于蟲(chóng)草科的蟲(chóng)草屬、Samsoniella以及線蟲(chóng)草科的多頭霉屬和線蟲(chóng)草屬。

本次研究表明，巍山地區(qū)北部紅河源樣地具有較高的蟲(chóng)草物種多樣性，南部的小雞足山的蟲(chóng)草物種多樣性較低，推測(cè)可能與巍山地勢(shì)北高南低且海拔懸殊較大，中部被山脈阻隔劃分為不同水系導(dǎo)致南北部森林植被不同有關(guān)。此外，物種多樣性最高的紅河源樣地森林植被覆蓋良好且物種豐富，山間流淌溪流，空氣濕度大且昆蟲(chóng)種類豐富，因而造就了該地區(qū)獨(dú)特和豐富的蟲(chóng)草多樣性。小雞足山山間種植許多的經(jīng)濟(jì)作物且山頂有祭祀等活動(dòng)，人類干擾較大，空氣濕度相對(duì)較低，昆蟲(chóng)種類及豐度不大,因而該地區(qū)的蟲(chóng)草物種多樣性相對(duì)較低。因此蟲(chóng)草更適宜生活在人為干擾較低、氣候條件優(yōu)越、且生物多樣性較高的自然生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)[26]。

表4 巍山樣地間的蟲(chóng)草物種相似性系數(shù)Table 4 Similarity coefficient (Cs) of Cordyceps sensu lato among plots in Weishan County

巍山地區(qū)蟲(chóng)草資源優(yōu)勢(shì)種屬現(xiàn)象明顯，優(yōu)勢(shì)屬為蟲(chóng)草屬，優(yōu)勢(shì)種為蛹蟲(chóng)草，占菌株總數(shù)的27%。蛹蟲(chóng)草為世界廣布種，分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，具有較寬的生態(tài)位，對(duì)森林生態(tài)系統(tǒng)的昆蟲(chóng)群落數(shù)量的穩(wěn)定具有重要作用。此外，蛹蟲(chóng)草藥食同源，具有卓越的醫(yī)藥用途和保健價(jià)值，含有多種活性成分，其在免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗腫瘤和抗病毒上具有重要的藥理作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和保健品中。前期研究表明，蛹蟲(chóng)草發(fā)生與生態(tài)環(huán)境因子的綜合作用有密切關(guān)系，主要影響因子包括溫濕度、植被類型、寄主昆蟲(chóng)以及土壤質(zhì)地等[27]，不同生境下蛹蟲(chóng)草變異式樣差異較大，主要包括子座大小與子囊大小以及著生方式上的區(qū)別[28-29]。本次調(diào)查不同生境樣地中，紅河源樣地的蛹蟲(chóng)草豐富度最高，但形態(tài)比其他樣地較小，子座相對(duì)較短, 可能是該樣地蟲(chóng)草物種多樣性較高，寄主鱗翅目蛹昆蟲(chóng)在較小時(shí)便被感染，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以長(zhǎng)出粗長(zhǎng)的子座，導(dǎo)致該地區(qū)蛹蟲(chóng)草形態(tài)較小，但豐富度很高。

巍山地區(qū)北部紅河源樣地與東部巍寶山樣地的蟲(chóng)草物種相似度最高，相似系數(shù)為0.64，表明兩樣地的蟲(chóng)草物種最為相似；南部小雞足山與中部衛(wèi)東林場(chǎng)樣地物種相似系數(shù)為0.24，表明兩地的物種相似度最低?？赡艿乩砀綦x的因素更能決定蟲(chóng)草的分布和物種組成的相似性，可以為日后對(duì)野外蟲(chóng)草調(diào)查提供參考。

巍山地區(qū)的蟲(chóng)草資源調(diào)查豐富了大理州乃至云南省的蟲(chóng)草物種資源庫(kù)，同時(shí)為云南省及國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的蟲(chóng)草資源調(diào)查奠定了一定基礎(chǔ)[30]。本次調(diào)查基本弄清該地區(qū)的蟲(chóng)草物種種類，對(duì)當(dāng)?shù)氐南x(chóng)草資源保護(hù)和可持續(xù)利用提供了理論依據(jù)。由于本次調(diào)查研究的取樣范圍以及采集到的蟲(chóng)草標(biāo)本有限，調(diào)查到的蟲(chóng)草資源物種主要涉及蟲(chóng)草科和線蟲(chóng)草科物種，對(duì)于未調(diào)查到的麥角菌科物種在日后對(duì)于滇中西部地區(qū)的真菌資源調(diào)查研究中尚需加強(qiáng)關(guān)注。