韓清華，謝興林，田曉清，李 涵，樊成奇

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006）

海洋微生物主要包括生活在海水、海洋沉積物中的微生物及與海洋動(dòng)植物共附生的微生物，是復(fù)雜動(dòng)態(tài)的海洋生態(tài)系統(tǒng)中一個(gè)獨(dú)特、重要的組成部分，在海洋的物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)、生態(tài)平衡、環(huán)境凈化中承擔(dān)著重要的角色，對(duì)于維持海洋系統(tǒng)的功能、物種及群落多樣性的演化具有不可替代的作用。而在海洋生態(tài)系統(tǒng)漫長(zhǎng)的演化過程中，海洋微生物形成了獨(dú)特和多樣的機(jī)制來適應(yīng)高壓、黑暗、高鹽、低溫和寡營(yíng)養(yǎng)等嚴(yán)酷的生存環(huán)境，從而進(jìn)化出基因型、代謝途徑和生理生態(tài)功能的多樣性，成為地球上最豐富和最重要的戰(zhàn)略資源。據(jù)估計(jì)海洋微生物物種達(dá)2～10億種，具有陸生微生物所無法比擬的生態(tài)群落結(jié)構(gòu)多樣性和物種多樣性［1］。因此，對(duì)海洋微生物資源的利用與開發(fā)已成為當(dāng)今國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域［2］。海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物是海洋微生物代謝產(chǎn)物的主要來源，從2010年起，海洋真菌中發(fā)現(xiàn)的新的次級(jí)代謝產(chǎn)物占海洋微生物的比例超過50%，約占海洋天然產(chǎn)物的三分之一［3］，其中活性化合物超過50%。表明海洋真菌是發(fā)現(xiàn)新化合物、開發(fā)海洋藥物的重要來源。

南海海域遼闊，面積約350萬km2，平均水深約1 212 m，最深處5 559 m；其中，屬于我國(guó)的部分約210萬km2［4］。南海海洋生物資源種類繁多，有藻類（紅藻、褐藻、綠藻）、海綿動(dòng)物、腔腸動(dòng)物、軟體動(dòng)物、棘皮動(dòng)物、被囊動(dòng)物、苔蘚蟲類、微生物等；南海海洋生物量大，前期從南海海洋生物中發(fā)現(xiàn)許多結(jié)構(gòu)特異的次生代謝產(chǎn)物，如萜類、生物堿、糖類、脂類和甾體等，這些化合物不僅結(jié)構(gòu)類型特殊，而且具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗心血管病、抗氧化、神經(jīng)生長(zhǎng)與功能調(diào)節(jié)等活性，有望開發(fā)成新一代的海洋藥物。

真菌作為南海海洋環(huán)境中一個(gè)重要的微生物類群，因其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和活性多樣、創(chuàng)新指數(shù)高、成藥性強(qiáng)、產(chǎn)量大等特點(diǎn)，近年來倍受研究者關(guān)注，已成為海洋天然產(chǎn)物研究的熱點(diǎn)［5］，然而關(guān)于南海真菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究起步較晚，且研究對(duì)象多集中在深海來源真菌、紅樹林內(nèi)生菌、海綿、珊瑚及海星共附生真菌等［6－11］，對(duì)南海近海的漁業(yè)捕撈區(qū)域中的真菌及其代謝產(chǎn)物的研究較少，因此對(duì)該區(qū)域的研究將為豐富南海真菌資源多樣性、發(fā)掘結(jié)構(gòu)新穎的活性代謝產(chǎn)物提供基礎(chǔ)。本課題組前期從位于南海上川島沙堤漁港南32 km處表層海水中分離篩選到100多株真菌資源，并對(duì)其中部分菌株進(jìn)行蛋白磷酸酶活性篩選，結(jié)果表明其中部分菌株具有較好的蛋白磷酸酶活性。本研究擬通過對(duì)兩株活性較好的潛在菌株Aspergillusaculeatus1 P1和Paraconiothyrium cyclothyrioides1 I2的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步研究，分析其活性潛能，以期為南海真菌資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生物材料：海水采自2018年6月12日南海上川島沙堤漁港南32 km處（水深0.5 m），站位112°42′E、21°19′N，冷藏保存運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

微生物鑒定材料：真菌DNA小劑量快速提取試劑盒（上海生工生物公司）；18S引物（上海美吉生物公司）；PCR擴(kuò)增體系（康為世紀(jì)）。

色譜填料和試劑：HP 20大孔吸附樹脂（Mitsubishi Chemical Ltd，Japan）；凝膠Sephadex LH 20（Pharmacia Biotech，Sweden）；預(yù)制GF254 TLC硅膠板（青島海洋化學(xué)公司）；液相用乙腈、甲醇（色譜級(jí)，Tedia，USA）；其余溶劑均為分析純（AR，上海國(guó)藥集團(tuán)）。

分離培養(yǎng)基：孟加拉紅固體培養(yǎng)基（葡萄糖10.0 g，蛋白胨5.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂20.0 g，1／3000孟加拉紅溶液100 mL，陳海水1 000mL）［12］；PDA固體培養(yǎng)基（馬鈴薯200.0 g，葡萄糖10.0 g，瓊脂18.0 g，陳海水1 000 mL）；YPD固體培養(yǎng)基（酵母膏10.0 g，蛋白胨20.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，陳海水1 000 mL）。用于分離菌株時(shí)每種培養(yǎng)基添加氯霉素和萘啶酮酸各30 U·mL－1，pH 6.0～6.5［13］。發(fā)酵培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基。

1.2 儀器

高壓滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠，LDZX 75KBS型；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司，DHG 9123A型；微生物恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司，DHP 9162A型；高速微量離心機(jī)：上海生工生物有限公司，HICO 21型；PCR儀：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，AG 22331型；凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司，GIS 1600型；酶標(biāo)儀：TECAN，SPARK 10M型；半制備HPLC系統(tǒng)：Shimadazu，LC 20AT pump，SIL 20A auto sampler，SPD M20A PDA detector；NMR：Bruker，AM 400 spectrometer（TMS內(nèi)標(biāo)）；UPLC MS：Agilent，1290 HPLC 6224 TOFMS。

1.3 共附生微生物的分離和培養(yǎng)

1.3.1 菌株的分離

將海水樣品過濾，濾紙剪碎后放至裝有10 mL無菌水的50 mL無菌離心管內(nèi)，震蕩混勻后靜置于4℃冰箱過夜。將樣品懸液進(jìn)行10－1、10－2、10－3的梯度稀釋，每個(gè)梯度分別取100μL涂布于孟加拉紅、PDA和YPD固體培養(yǎng)基上，將平板放于27℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)［14］。培養(yǎng)約1～2周后長(zhǎng)出菌落，根據(jù)顏色、形態(tài)等特征挑取差異較大的菌落，接種至相應(yīng)新鮮培養(yǎng)基上繼續(xù)分離培養(yǎng)。最終得到的菌株保存于YPD斜面培養(yǎng)基，編號(hào)并置于4℃冰箱備用。

1.3.2 18S rDNA ITS序列分析

將真菌液體發(fā)酵液減壓抽濾濃縮得菌絲體，取適量菌體于研缽中，加液氮充分研磨至粉末狀［15］。使用真菌DNA小劑量快速提取試劑盒提取真菌基因組DNA，并于－20℃保存?zhèn)溆?。采?8S EF3：TCCTCTAAATGACCRAGTTTG和18S EF4：GGAAGGGRTGTATTTATTAG，擴(kuò)增真菌18S rDNA ITS序列。

PCR擴(kuò)增體系為50μL：2×PCR MasterMix 25μL，引物各2μL，模板DNA 5μL，重蒸水16 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min［16］。取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠，100 V電泳30 min，檢測(cè)DNA大小，然后用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。提取的基因組DNA于－20℃保存，統(tǒng)一送上海美吉生物科技有限公司測(cè)序。所測(cè)結(jié)果在NCBI網(wǎng)站比對(duì)并進(jìn)行種屬歸類，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)選擇編號(hào)為1 P1（Aspergillusaculeatus1 P1）和1 I2（Paraconiothyriumcyclothyrioides1 I2）的兩株真菌進(jìn)行代謝產(chǎn)物研究。

1.4 1 P1和1 I2菌株中化合物分離純化

1.4.1 菌株發(fā)酵培養(yǎng)

配制2瓶800 mL YPD液體培養(yǎng)基，置于2 L三角瓶中，121℃高溫滅菌30 min，再分別接入經(jīng)過活 化 培 養(yǎng) 的1 P1和1 I2菌 株，20°C、160 r·min－1進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，5 d后得到種子發(fā)酵液。將1 P1菌株種子液按一定比例接種于含有0.75 L YPD液體培養(yǎng)基的2 L三角瓶中，在20℃、160 r·min－1分3批進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每批發(fā)酵培養(yǎng)10～15 d；將1 I2菌株種子液按一定比例接種于含有0.75 L馬丁氏液體培養(yǎng)基（KH2PO4：1g，MgSO4·7H2O：0.5 g，蛋白胨：5 g，葡萄糖：5 g）的2 L三角瓶中，在20℃、160 r·min－1分3批進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每批發(fā)酵培養(yǎng)10～15 d，兩株菌均得到約60 L發(fā)酵液。

1.4.2 1 P1中化合物的提取分離

菌株1 P1的發(fā)酵液經(jīng)抽濾得到菌絲體，菌絲體置于－80℃冰箱中冷凍，然后取出自然解凍破壁，依次加入2 L的丙酮和甲醇進(jìn)行超聲破碎，分別提取3次，提取液減壓低溫濃縮除去有機(jī)溶劑，合并提取液并蒸干。濃縮后的浸膏加1.5 L純水溶解充分，然后分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，得到相應(yīng)的石油醚（9.2 g）、乙酸乙酯（2.9 g）和正丁醇萃取物（22.6 g）。

1 P1的乙酸乙酯部分經(jīng)Sephadex LH 20凝膠柱層析分離，氯仿∶甲醇為1∶1進(jìn)行洗脫，得到Fr.1～Fr.5共5部分，將Fr.2經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備（流動(dòng)相∶乙腈－0.1%三氟乙酸 水）得到化合物5（9.1 min）、6（13.2 min）、1（24.5 min）；將Fr.4經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備（流動(dòng)相：乙腈－0.1%三氟乙酸 水）得到化合物10（14.7 min）、11（27.7 min）、9（12.4 min）；將Fr.3經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備（流動(dòng)相：乙腈－0.1%三氟乙酸 水）得到化合物7（14.0 min）和8（29.8 min）。1 P1的石油醚部分經(jīng)正相硅膠柱進(jìn)行分離，分別用氯仿∶甲醇為100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1的梯度洗脫，得到Fr.Ⅰ～Fr.Ⅴ共5部分，將Fr.Ⅲ經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備（流動(dòng)相∶乙腈－0.1%三氟乙酸 水）得到化合物2（21.5 min）；將Fr.Ⅴ經(jīng)Sephadex LH 20凝膠柱層析分離，氯仿∶甲醇為1∶1進(jìn)行洗脫，得到化合物3和4。

1.4.3 1 I2中化合物的提取分離

菌株1 I2的發(fā)酵液經(jīng)抽濾得到菌絲體，菌絲體置于－80℃冰箱中冷凍，然后取出自然解凍破壁，依次加入2 L的丙酮和甲醇進(jìn)行超聲破碎，分別提取3次，提取液減壓低溫濃縮除去有機(jī)溶劑，合并提取液并蒸干。濃縮后的浸膏加1.0 L純水溶解充分，然后分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，得到相應(yīng)的石油醚（12.5 g）、乙酸乙酯（814 mg）和正丁醇萃取物（15.0 g）。

將1 I2的石油醚部分經(jīng)正相硅膠柱進(jìn)行分離，分別用氯仿∶甲醇為100∶1、60∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1的梯度洗脫，得到Fr.A～Fr.F共6部分，將Fr.C經(jīng)Sephadex LH 20凝膠柱層析分離，氯仿∶甲醇為1∶1進(jìn)行洗脫，得到化合物12；將Fr.B經(jīng)正相硅膠柱進(jìn)行分離，用石油醚：丙酮為30∶1洗脫，得到化合物14；將Fr.E經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備（流動(dòng)相∶乙腈－0.1%三氟乙酸 水），得到化合物16（18.5 min）、17（19.4 min）和15（21.2 min）；將Fr.F經(jīng)反相硅膠柱進(jìn)行分離，甲醇 水進(jìn)行洗脫，得到化合物13。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果

2株菌株送樣均測(cè)序拼接成功。將上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司所測(cè)結(jié)果在NCBI網(wǎng)站比對(duì)，種屬歸類如表1。

2.2 真菌1 P1、1 I2化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 1 P1中次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合 物1：白 色 無 定 形 粉 末，1H NMR（CD3OD，600 MHz）數(shù)據(jù)如下：4.25（1H，d，J＝7.8 Hz），4.11（1H，d，J＝10.8 Hz），3.85（1H，dd，J＝12.9，2.1 Hz），3.75（1H，s），3.62（1H，dd，J＝9.0，7.8 Hz），3.53（1H，d，J＝3.6 Hz），3.39（1H，d，J＝10.8 Hz），2.17（1H，dd，J＝6.9，3.6 Hz），1.21（3H，s），1.18（3H，s），1.00（6H，d，J＝7.8 Hz），0.94（6H，d，J＝10.8 Hz），13C NMR（CD3OD，125 MHz）數(shù)據(jù)如下：39.7（C 1），28.6（C 2），81.2（C 3），43.5（C 4），57.2（C 5），19.8（C 6），34.0（C 7），41.2（C 8），48.9（C 9），37.1（C 10），24.9（C 11），123.5（C 12），145.1（C 13），42.7（C 14），27.3（C 15），28.3（C 16），40.0（C 17），45.3（C 18），48.0（C 19），37.8（C 20），76.8（C 21），93.4（C 22），23.2（C 23），65.3（C 24），16.5（C 25），17.3（C 26），27.0（C 27），23.2（C 28），31.3（C 29），21.3（C 30），108.8（C 1′），73.9（C 2′），75.3（C 3′），70.2（C 4′），67.7（C 5′），以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17］報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，因此鑒定化合物為kudzusaponin SA4。

化合 物2：白 色 無 定 形 粉 末，1H NMR（CDCl3，600 MHz）數(shù)據(jù)如下：5.25（1H，d，J＝3.6 Hz），3.45（1H，d，J＝4.5 Hz），1.11（3H，s），1.04（3H，s），0.94（3H，s），0.91（3H，s），0.90（3H，s），0.87（3H，s），13C NMR（CDCl3，125 MHz）數(shù)據(jù)如下：38.5（C 1），26.0（C 2），80.9（C 3），42.2（C 4），56.0（C 5），18.6（C 6），33.2（C 7），39.8（C 8），47.8（C 9），37.5（C 10），23.9（C 11），122.4（C 12），144.0（C 13），42.8（C 14），28.3（C 15），27.7（C 16），36.8（C 17），44.9（C 18），46.3（C 19），30.6（C 20），41.6（C 21），76.7（C 22），22.5（C 23），64.6（C 24），16.3（C 25），17.0（C 26），25.5（C 27），29.8（C 28），32.9（C 29），20.1（C 30），以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，因此鑒定化合物為大豆皂醇。

化合物3：白色無定形粉末，1H NMR（Pyr，600 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH5.74（1H，brs），5.26（1H，dd，J＝15.3，7.5 Hz），5.19（1H，dd，J＝15.0，8.4 Hz），4.83（1H，m），3.03（1H，t，J＝12.3 Hz），2.56（1H，m），1.54（3H，s），1.07（3H，d，J＝6.0 Hz），0.97（3H，d，J＝7.2 Hz），0.88（3H，d，J＝5.4 Hz），0.86（3H，d，J＝6.0 Hz），0.67（3H，s），13C NMR（Pyr，125 MHz）數(shù)據(jù)如下：δC33.0（C 1），33.7（C 2），67.9（C 3），42.3（C 4），76.5（C 5），74.6（C 6），120.8（C 7），141.9（C 8），44.1（C 9），38.4（C 10），22.7（C 11），40.2（C 12），44.1（C 13），55.6（C 14），23.8（C 15），28.8（C 16），56.4（C 17），12.9（C 18），19.2（C 19），41.2（C 20），20.5（C 21），136.5（C 22），132.4（C 23），43.4（C 24），34.2（C 25），21.8（C 26），20.2（C 27），30.4（C 28），18.2（C 29），以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［19］報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，因此鑒定該化合物為24 ethylcholesta 7，22 diene 3β，5α，6β triol。

化合 物4：白 色 無 定 形 粉 末，1H NMR（CDCl3，600 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH5.57（1H，m），5.20（2H，m），3.64（1H，m），1.03（3H，d，J＝6.6 Hz），0.94（3H，s），0.92（3H，d，J＝6.6 Hz），0.84（3H，d，J＝7.2 Hz），0.82（3H，d，J＝6.6 Hz），13C NMR（CDCl3，125 MHz）數(shù)據(jù)如下：39.3（C 1），32.1（C 2），70.7（C 3），37.2（C 4），139.9（C 5），119.8（C 6），116.5（C 7），141.5（C 8），46.4（C 9），38.5（C 10），21.3（C 11），40.6（C 12），42.9（C 13），54.7（C 14），23.2（C 15），28.4（C 16），55.9（C 17），12.2（C 18），16.4（C 19），40.9（C 20），21.3（C 21），135.7（C 22），132.1（C 23），43.0（C 24），33.2（C 25），19.8（C 26），20.1（C 27），17.8（C 28），以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［20］報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，因此鑒定該化合物為（22E，24R） ergosta 5，7，22 trien 3β ol。

圖1 從南海真菌Aspergillus aculeatus 1 P1和Paraconiothyrium cyclothyrioides 1 I2中分離得到的化合物結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas of compounds isolated from two South China Sea fungi Aspergillus aculeatus 1 P1 and Paraconiothyrium cyclothyrioides 1 I2

化合物5：淺褐色無定型粉末，1H NMR（CD3OD，400 MHz）信號(hào)：δH0.12（1H，m），0.72（3H，d，J＝6.7 Hz），0.86（1H，m），1.21～1.38（1H，m），2.80（1H，m），3.18（1H，m），3.65（1H，m），4.21（1H，m），6.69（2H，d，J＝7.8 Hz），6.97（2H，d，J＝7.8 Hz）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［21］報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，鑒定為已知化合物4 羥基苯丙氨酸 亮氨酸。

化合物6：淺黃色油狀物，HR ESI MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰m／z245.128 3（［M＋H］＋，計(jì)算值為245.128 5），提示其分子式為C14H16N2O2。1H NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH7.27（5H，m），4.46（1H，s），4.09（1H，dd，J＝11.2，2.8 Hz），3.56（1H，dd，J＝18.8，8.0 Hz），3.39（1H，m），3.18（2H，m），2.10（1H，m），1.82（2H，m），1.24（1H，m）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［22］報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，鑒定為已知化合物環(huán)（苯丙氨酸 脯氨酸）。

化合物7：淺黃色粉末，HR ESI MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰m／z261.117 7（［M＋H］＋，計(jì)算值為261.116 1），提示其分子式為C14H16N2O3。1H NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH7.04（1H，d，J＝8.4 Hz），6.70（1H，d，J＝8.8 Hz），4.36（1H，tlike），4.04（1H，dd，J＝11.0，7.4 Hz），3.54（1H，m），3.36（1H，m），3.06（2H，m），2.19（1H，m），1.80（2H，m），1.21（1H，m）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［23］報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，鑒定為已知化合物cyclo （L Pro L Tyr）。

化合物8：淺黃色油狀物，1H NMR（CD3OD，600 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH7.55（1H，d，J＝7.8 Hz），7.32（1H，d，J＝7.8 Hz），7.06（3H，m），2.94（2H，t，J＝7.2 Hz）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［24］報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，因此鑒定該化合物為已知芳香胺類化合物色胺，即吲哚乙胺。

化合物9：黃色無定形粉末，HR ESI MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰m／z138.089 9（［M＋H］＋，計(jì)算 值 為138.091 3），提 示 其 分 子 式 為C8H11NO。1H NMR（CD3OD，600 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH7.03（2H，d，J＝8.4 Hz），6.70（2H，d，J＝8.4 Hz），3.68（2H，t，J＝7.2 Hz），2.71（2H，t，J＝7.2 Hz）。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［25］報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，鑒定為對(duì)羥基苯乙胺。

化合物10：無色固體，HR ESI MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰m／z255.064 6（［M＋H］＋，計(jì)算值為255.061 3），提示其分子式為C15H10O4。1H NMR（Pyr，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH8.47（1H，d，J＝8.4 Hz），8.17（1H，s），7.86（1H，d，J＝8.4 Hz），7.82（2H，d，J＝8.4 Hz），7.29（2H，d，J＝8.4 Hz），7.12（1H，d，J＝2.4 Hz）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［26］報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，鑒定為異黃酮類化合物7，4′ 二羥基異黃酮。

化合物11：淺黃色固體，1H NMR（CDCl3，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH8.13（1H，s），8.06（1H，d，J＝8.8 Hz），7.37（2H，d，J＝8.8 Hz），6.94（1H，dd，J＝8.6，1.8 Hz），6.85（2H，d，J＝8.8 Hz）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［27］報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，因此鑒定該化合物為異黃酮類化合物5，7，4 三羥基異黃酮。

2.2.2 1 I2中次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物12：白色粉末，1H NMR（CDCl3，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH6.50（1H，d，J＝8.4 Hz），6.23（1H，d，J＝8.4 Hz），5.21（1H，dd，J＝15.2，7.6 Hz），5.14（1H，dd，J＝15.2，8.0 Hz），3.96（1H，m），0.99（3H，d，J＝6.4 Hz），0.90（3H，d，J＝6.8 Hz），0.88（3H，s），0.83（3H，d，J＝6.4 Hz），0.81（3H，s），13C NMR（CDCl3，100 MHz）數(shù)據(jù)如下：34.7（C 1），30.1（C 2），66.4（C 3），36.9（C 4），82.1（C 5），135.4（C 6），130.7（C 7），79.4（C 8），51.1（C 9），37.0（C 10），23.4（C 11），39.3（C 12），44.5（C 13），51.7（C 14），20.6（C 15），28.6（C 16），56.2（C 17），12.9（C 18），18.2（C 19），39.7（C 20），20.9（C 21），135.2（C 22），132.3（C 23），42.8（C 24），33.0（C 25），19.6（C 26），19.9（C 27），17.5（C 28），以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［28］報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，因此鑒定該化合物為（22E） 5α，8α Epidioxyergosta 6，22 dien 3β ol。

化合物13：淡黃色粉末，1H NMR（DMSO，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：7.87（1H，d，J＝8.4 Hz），5.77（1H，d，J＝5.2 Hz），5.63（1H，d，J＝8.4 Hz），13C NMR（DMSO，100 MHz）數(shù)據(jù)如下：150.8（C 2），163.2（C 4），101.8（C 5），140.8（C 6），87.8（C 2′），73.6（C 3′），69.9（C 4′），84.9（C 5′），63.2（C 6′），以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［29］報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，因此鑒定該化合物為尿嘧啶核苷。

化合物14：無色油狀物，1H NMR（CDCl3，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH5.36（4H，m），3.66（3H，s），2.77（2H，t，J＝6.2 Hz），2.32（2H，t，J＝7.4 Hz），2.05（4H，m），1.59（2H，m），0.89（3H，t，J＝6.4 Hz），13C NMR（CDCl3，100 MHz）數(shù)據(jù)如下：174.3（C 1），34.1（C 2），24.9（C 3），29.1（C 4），29.1（C 5），29.3（C 6），29.6（C 7），27.2（C 8），130.0（C 9），127.9（C 10），25.6（C 11），128.0（C 12），130.2（C 13），27.2（C 14），29.1（C 15），31.5（C 16），22.6（C 17），14.0（C 18），51.4（－OCH3），以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［30］報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，因此鑒定該化合物為Methyl Linoleate。

化合物15：無色油狀物，1H NMR（CDCl3，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH5.34（4H，m），3.93（1H，m），3.69（1H，dd，J＝11.4，3.9 Hz），3.60（1H，dd，J＝11.4，5.8 Hz），2.77（2H，t，J＝6.3 Hz），2.35（2H，t，J＝7.6 Hz），2.04（4H，dd，J＝14.0，7.0 Hz），2.04（4H，dd，J＝13.4，6.6 Hz），1.63（2H，m，H 3′），0.89（3H，t，J＝6.8 Hz），13C NMR（CDCl3，100 MHz）數(shù)據(jù)如下：174.3（C 1），34.1（C 2），24.9（C 3），29.1（C 4），29.1（C 5），29.3（C 6），29.6（C 7），27.2（C 8），130.0（C 9），127.9（C 10），25.6（C 11），128.1（C 12），130.2（C 13），27.2（C 14），29.1（C 15），31.5（C 16），22.6（C 17），14.1（C 18），65.2（C 1′），70.3（C 2′），63.3（C 3′），以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［31］報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，因此鑒定該化合物為1O（9Z，12Z octadecadienoyl）glycerol。

化合物16：淡黃色油狀物，1H NMR（CDCl3，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH5.65（1H，m），5.55（1H，m），5.48（1H，m），5.37（1H，m），4.09（1H，dd，J＝12.8，6.2 Hz），2.34（2H，t，J＝7.4 Hz），2.04（4H，m），1.64（2H，m），0.89（3H，t，J＝6.8 Hz），13C NMR（CDCl3，100 MHz）數(shù)據(jù)如下：177.8（C 1），32.0（C 2），24.6（C 3），29.3（C 4），28.6（C 5），28.8（C 6），33.7（C 7），133.4（C 8），132.4（C 9），72.5（C 10），35.4（C 11），124.5（C 12），132.0（C 13），27.4（C 14），28.8（C 15），31.5（C 16），22.6（C 17），14.1（C 18），以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［32］報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，因此鑒定該化合物為（8E，12Z） 10 Hydroxy 8，12 octadecadienoic acid。

化合物17：無色油狀物，1H NMR（CDCl3，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH5.36（4H，m），4.93（1H，m），3.83（4H，brd，J＝4.4 Hz），2.77（2H，brt，J＝6.2 Hz），2.37（1H，t，J＝7.4 Hz），2.05（4H，dd，J＝13.4，6.6 Hz，），1.64（2H，m），0.89（3H，t，J＝6.6 Hz），13C NMR（CDCl3，100 MHz）數(shù)據(jù)如下：174.0（C 1），34.3（C 2），25.0（C 3），29.1（C 4），29.2（C 5），29.3（C 6），29.6（C 7），27.2（C 8），130.0（C 9），127.9（C 10），25.6（C 11），128.1（C 12），130.2（C 13），27.2（C 14），29.1（C 15），31.5（C 16），22.6（C 17），14.1（C 18），75.1（C 1′），62.6（C 2′），62.6（C 3′），以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［31］報(bào)道的數(shù)據(jù)一致，因此鑒定該化合物為2 linoleoylglycerol。

3 討論與展望

本文對(duì)位于南海上川島沙堤漁港南32 km處表層海水中獲得的2株真菌Aspergillus aculeatus1 P1和Paraconiothyrium cyclothyrioides1 I2的 化 學(xué) 成 分 進(jìn) 行 了 研 究，從Aspergillus aculeatus1 P1中分離得到11個(gè)化合物，從Paraconiothyriumcyclothyrioides1 I2中分離得到6個(gè)化合物，化合物類型包括萜類、甾醇、環(huán)二肽、脂肪酸等，學(xué)者前期對(duì)棘孢曲霉Aspergillus aculeatus的化學(xué)成分研究結(jié)果表明其中主要的化合物類型包括倍半萜類［33－34］、衣康酸衍生物和二酮哌嗪類［35］；Paraconiothyrium屬作為2004年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)屬，近年來有多位學(xué)者對(duì)其進(jìn)行化學(xué)成分及活性研究，對(duì)該屬的化學(xué)成分研究結(jié)果表明其中主要的化合物類型包括二萜烷類［36－37］、呋喃酮類［38］、異海松烷型二萜苷［39］、倍半萜類［40－43］、聚酮類［44］、縮酮類［45］，活性研究結(jié)果表明部分二萜烷類、倍半萜類及縮酮類化合物具有細(xì)胞毒、抗菌及抗病毒活性，表明該屬微生物具有一定的代謝潛力，但是本研究從Paraconiothyriumcyclothyrioides1 I2中獲得的次級(jí)代謝產(chǎn)物種類較少，化合物結(jié)構(gòu)類型與其他研究結(jié)果相比也較為簡(jiǎn)單，猜測(cè)一方面可能是由于本研究所獲得的微生物樣本均來源于表層海水（0.5 m），而表層海水及沉積物環(huán)境相對(duì)較為簡(jiǎn)單，與中底層海水及沉積物復(fù)雜環(huán)境相比，缺乏特殊的條件來刺激誘導(dǎo)真菌產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物及生物活性［46］，另一方面，猜測(cè)可能是培養(yǎng)基較為單一、且培養(yǎng)條件較為簡(jiǎn)單的緣故。雖然課題組在前期嘗試過利用5種不同培養(yǎng)基對(duì)Paraconiothyriumcyclothyrioides1 I2的代謝產(chǎn)物多樣性進(jìn)行分析，并選擇了代謝產(chǎn)物多樣性最為豐富的馬丁氏培養(yǎng)基作為發(fā)酵條件，但是從研究結(jié)果來看，仍然未得到較為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。

近年來借助于飛速發(fā)展的基因組測(cè)序和生物信息數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)發(fā)現(xiàn)，微生物具有產(chǎn)生豐富次生代謝產(chǎn)物的遺傳基礎(chǔ)，其代謝潛能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過先前的認(rèn)識(shí)，許多新的次生代謝產(chǎn)物編碼基因和基因簇陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。常規(guī)發(fā)酵條件優(yōu)化過程對(duì)于挖掘南海真菌中新結(jié)構(gòu)代謝產(chǎn)物效率不高，沉默的生物合成基因簇限制了次生代謝產(chǎn)物的多樣性和新穎性。前期研究發(fā)現(xiàn)一株黃曲霉Aspergillusflavus中共含有編碼56個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物的基因簇，但僅有少量編碼合成leporin類、黃曲霉毒素類、偶氮酸、哌嗪類等化合物的基因簇被發(fā)現(xiàn)［47］。在后基因組時(shí)代的今天，迫切需要研究利用各種沉默基因激活方法，提高南海真菌代謝產(chǎn)生各類活性天然產(chǎn)物的效率。

蛋 白翻譯后修飾（post translational modification，PTM）是指對(duì)翻譯后的蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)加工的過程，通過一系列酶催化的在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基加上或消除修飾基團(tuán)的動(dòng)態(tài)過程，改變蛋白質(zhì)物化性質(zhì)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)功效；其中最為頻繁的修飾包括磷酸化、乙?；?、甲基化和泛素化等［48］。其研究熱點(diǎn)在于利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究相關(guān)的重大疾病新靶點(diǎn)、新機(jī)制；在微生物代謝產(chǎn)物研究中，也有用于挖掘生物合成基因簇潛力、代謝產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)產(chǎn)物的嘗試。幾種修飾模式中研究較為透徹的是組蛋白的乙?；图谆饔谩＝M蛋白修飾在真菌基因的表達(dá)中有廣泛的應(yīng)用，組蛋白乙?；腿ゼ谆蛊浣Y(jié)構(gòu)呈松散狀，有利于基因的轉(zhuǎn)錄，反之則使基因處于沉默狀態(tài)。研究效果顯著的例子是利用組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑增加真菌細(xì)胞內(nèi)組蛋白的乙酰化程度，有利于DNA與組蛋白八聚體的解離使核小體結(jié)構(gòu)趨于松弛，從而利于各種轉(zhuǎn)錄因子、協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合位點(diǎn)的特異性結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄，尤其是提高代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平，成功改善了菌株代謝產(chǎn)物的多樣性或產(chǎn)量［49］。HENRIKSON等［50］在黑曲霉培養(yǎng)基中添加組蛋白去乙?；敢种苿┓⒅Z他（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）后發(fā)現(xiàn)14個(gè)生物合成基因簇的表達(dá)量有大幅度提高，從而使黑曲霉代謝途徑發(fā)生改變，最終從發(fā)酵液中分離得到1個(gè)全新的代謝產(chǎn)物nygerone A，也是在黑曲霉中首次報(bào)道產(chǎn)生。前期本課題組利用SAHA對(duì)一株南極黃曲霉Aspergillussp.NJF3進(jìn)行蛋白翻譯后磷酸化修飾調(diào)控的嘗試，結(jié)果表明其代謝產(chǎn)物多樣性、特定成分產(chǎn)量有明顯變化，后期將進(jìn)一步優(yōu)化真菌的發(fā)酵條件，嘗試使用不同的海洋真菌培養(yǎng)基，嘗試適合的代謝調(diào)控方法，擴(kuò)大發(fā)酵規(guī)模并富集微量成分，以期獲得較為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)新穎性化合物。

本研究結(jié)果豐富了研究者對(duì)南海真菌多樣性及其代謝產(chǎn)物活性的了解，為藥源微生物發(fā)掘提供資源保障，同時(shí)也為研究人員通過活性追蹤方法、有目的地深入開展其代謝產(chǎn)物化學(xué)多樣性和活性研究提供指導(dǎo)。