江天棋，張 揚(yáng)，姜亞洲，孫 鵬，凌建忠，唐保軍

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3.上海海洋大學(xué)海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心，上海 201306）

葉綠素a（Chla）是估算海洋初級(jí)生產(chǎn)力和評(píng)估海水富營(yíng)養(yǎng)化程度的重要指標(biāo)之一［1］。準(zhǔn)確測(cè)定水體中Chla濃度對(duì)于評(píng)價(jià)水體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)及水域生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)狀況具有重要意義［2］。雖然水體Chla濃度的測(cè)定方法已有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 17378.7 2007、GB／T 12763.6 2007）和環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)（HJ 897 2017）［3－5］可參考，但在實(shí)際分析操作中仍存在一些尚未解決的問題。比如，上述標(biāo)準(zhǔn)都采用了玻璃纖維濾膜，但出于成本考慮，纖維素酯類膜仍被許多研究單位使用，而纖維素酯類膜在丙酮中溶解不完全，存在微細(xì)膠體顆粒，這些顆粒在多大程度上會(huì)影響比色結(jié)果尚不明確。在提取方法上，GB 17378.7 2007標(biāo)準(zhǔn)是加90%丙酮溶液后振蕩，HJ 897 2017標(biāo)準(zhǔn)則采用了研磨方法；在提取時(shí)間、樣品保存時(shí)間方面兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)也有所不同。此外，單胞藻經(jīng)常作為指示物應(yīng)用在濾食性動(dòng)物濾水率的測(cè)定中［6－7］，而有研究表明丙酮對(duì)柵藻（Scenedesmussp.）、小球藻（Chlorellasp.）、微擬球藻（Nannochlorissp.）等綠藻的提取效果不佳［8－9］，雖然研磨、勻漿、超聲等方法可以提高有機(jī)溶劑對(duì)Chla的提取效果［10］，但對(duì)不同單胞藻類Chla提取率的影響程度如何，尚待進(jìn)一步研究。

本文選擇了2種綠藻和1種硅藻，分析了不同濾膜和提取溶劑對(duì)Chla濃度測(cè)定結(jié)果的影響，比較了不同樣品提取時(shí)間、保存時(shí)間以及研磨和凍融兩種方法下丙酮對(duì)Chla的提取效果，并探討了如何降低纖維素酯類膜溶解后的微小顆粒對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，以期為海水Chla濃度的分析測(cè)定提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn) 采 用3種 濾 膜：孔 徑0.7μm的Whatman GF／F玻璃纖維濾膜（GE healthcare life sciences）、孔徑0.45μm的混合纖維素酯（水系）濾膜和孔徑0.45μm的聚偏氟乙烯微孔濾膜（上海興亞凈化材料廠）；3種單胞藻類（包含2種綠藻和1種硅藻）：蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidesa）、亞心形扁藻（Platymonas subcordiformis）和牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）；3種提取溶劑：90%丙酮、90%乙醇和甲醇。其他試劑和設(shè)備包括：碳酸鎂懸濁液、真空泵（津騰GM 0.5A）、臺(tái)式離心機(jī)（湘儀TG 16WS）、紫外可見分光光度計(jì)（上海精科752N）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水樣采集和處理

為模擬海水環(huán)境，以海水晶（浙江藍(lán)海星）配制鹽度為25的海水，然后分別加入各單胞藻液。水樣的過濾、Chla提取流程均參照GB 17378.7 2007《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第7部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測(cè)》［3］中Chla濃度的測(cè)定（分光光度法）。樣品采集后立即測(cè)定。對(duì)于比較凍融法與研磨法以及不同保存時(shí)間的樣品，則在水樣剛剛抽干后，將濾膜（添加碳酸鎂）對(duì)折，用錫箔紙封好，放到棕色塑料瓶中，置于－20℃保存。

1.2.2 不同濾膜和提取溶劑對(duì)Chla濃度測(cè)定結(jié)果的影響

配制海水50 L，加入100 mL蛋白核小球藻，充分混勻，分別用上述3種濾膜抽濾1 L水樣。采用凍融法［11］，將濾膜在－20℃冷凍1 h，取出室溫融解20 min，反復(fù)5次。然后將濾膜放入具塞離心管，分別加10 mL 90%丙酮、90%乙醇和甲醇，每種提取溶劑設(shè)4個(gè)平行，置于4℃避光浸泡12 h，3 500 r·min－1離心10 min提取Chla。牟氏角毛藻測(cè)定操作同上。

用分光光度法測(cè)定各Chla提取液在600～750 nm的吸收光譜。

1）對(duì)90%丙酮提取液，測(cè)定波長(zhǎng)750、664、647、630 nm處的吸光度值，參照GB 17378.7 2007標(biāo)準(zhǔn)，Chla濃度計(jì)算公式如下：

式（1）中，E750、E664、E647、E630分別為波長(zhǎng)750、664、647、630 nm處提取液的吸光度值，V丙酮為丙酮提取液體積（mL），V水樣為過濾水樣的體積（L），δ為比色皿光程（cm）。

2）參照金霞等［12］，體積分?jǐn)?shù)為90%的丙酮比吸光系數(shù)為89，而體積分?jǐn)?shù)90%乙醇的比吸光系數(shù)為87，因此用式（1）乘以1.023，得到如下公式：

式（2）中符號(hào)意義同式（1）。

3）對(duì)甲醇提取液，參照PORRA［8］方法，測(cè)定波長(zhǎng)750、665、652 nm處的吸光度值，Chla濃度計(jì)算公式如下：式（3）中，E750、E665、E652分別為波長(zhǎng)750、665、652 nm處提取液的吸光度值，其余符號(hào)意義同式（1）。

1.2.3 不同提取方法對(duì)Chla濃度測(cè)定結(jié)果的影響

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用玻璃纖維濾膜和90%丙酮，分析凍融和研磨對(duì)3種藻Chla濃度測(cè)定結(jié)果的影響。每種藻設(shè)4個(gè)平行。凍融操作同1.2.2。研磨操作參照HJ 897 2017標(biāo)準(zhǔn)［5］，采用10 mL玻璃勻漿器，加入6 mL 90%丙酮溶液，充分研磨5 min以上，沖洗，轉(zhuǎn)移至玻璃刻度離心管中，定容至10 mL，置于4℃避光浸泡12 h，3 500 r·min－1離心，分光光度法測(cè)定Chla濃度。

1.2.4 不同提取時(shí)間對(duì)Chla濃度測(cè)定結(jié)果的影響

以玻璃纖維濾膜和90%丙酮為提取溶劑，采用凍融法提取Chla，方法同1.2.2，分別在加入提取劑后6、12、24、48、72、96 h通過分光光度法測(cè)定Chla濃度。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)4個(gè)平行。

1.2.5 不同樣品保存時(shí)間對(duì)Chla濃度測(cè)定結(jié)果的影響

以玻璃纖維濾膜和90%丙酮為提取溶劑，水樣過濾后分別保存0、7、15、30、60 d。采用凍融法提取Chla，分光光度法測(cè)定Chla濃度。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)4個(gè)平行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用SPSS16.0軟件先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)化檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的進(jìn)行單因子方差分析和雙因子方差分析，并對(duì)不同濾膜與提取介質(zhì)、不同提取時(shí)間和保存時(shí)間的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行多重比較，以P＜0.05和P＜0.01表示差異有顯著和極顯著意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濾膜和提取溶劑對(duì)Chla濃度測(cè)定結(jié)果的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，玻璃纖維濾膜抽濾水樣速度最快，1 L水樣約需2～5 min；聚偏氟乙烯微孔濾膜抽濾速度最慢，1 L水樣約需45～60 min。加入90%丙酮后，混合纖維素濾膜完全溶解，聚偏氟乙烯濾膜和玻璃纖維濾膜仍保持完整。加入90%乙醇后，3種濾膜都沒有明顯變化。加入甲醇后，混合纖維素濾膜部分溶解，呈懸濁狀態(tài)，聚偏氟乙烯濾膜和玻璃纖維濾膜仍保持完整。

圖1 不同濾膜和提取溶劑對(duì)蛋白核小球藻Chla濃度測(cè)定的影響Fig.1 Effects of filter membranes and extraction solvents on measured Chla concentrations of C.pyrenoidesa

雙因子方差分析表明，不同濾膜和提取溶劑均對(duì)蛋白核小球藻Chla測(cè)定結(jié)果有極顯著差異（P＜0.01），90%丙酮提取的Chla測(cè)定結(jié)果極顯著低于其他兩種介質(zhì)（P＜0.01）（圖1）?；旌侠w維素濾膜和聚偏氟乙烯濾膜測(cè)定結(jié)果無顯著差異（P＝0.54）。不同濾膜和提取溶劑均對(duì)牟氏角毛藻Chla濃度測(cè)定結(jié)果有極顯著影響（P＜0.01）（圖2）。

為了判斷甲醇溶解濾膜對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，采用3 500 r·min－1（850 g）和8 000 r·min－1（4 450 g）兩種轉(zhuǎn)速對(duì)提取液進(jìn)行離心。結(jié)果顯示，3 500 r·min－1離心后，混合纖維素濾膜提取液仍呈懸濁狀態(tài)，而8 000 r·min－1離心后，提取液上部澄清。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速升高后，混合纖維素濾膜測(cè)定的Chla濃度顯著下降（P＜0.01）（圖3），玻璃纖維濾膜測(cè)定結(jié)果雖然也顯著下降（P＜0.05），但幅度較小，而聚偏氟乙烯濾膜無顯著差異。

圖2 不同濾膜和提取溶劑對(duì)牟氏角毛藻Chla濃度測(cè)定的影響Fig.2 Effects of filter membranes and extraction solvents on measured Chla concentrations of C.muelleri

圖3 不同離心轉(zhuǎn)速下甲醇提取蛋白核小球藻Chla濃度測(cè)定結(jié)果Fig.3 Determ ination of Chla concentrations in C.pyrenoidosa by methanol extraction at different centrifugal speeds

2.2 不同提取方法對(duì)Chla濃度測(cè)定結(jié)果的影響

結(jié)果顯示，采用凍融法測(cè)定的牟氏角毛藻和亞心形扁藻Chla濃度值均高于研磨法（圖4），但雙因子方差分析表明兩種處理方法之間無顯著性差異。凍融法測(cè)定的蛋白核小球藻Chla濃度極顯著低于研磨法（P＜0.01），僅為研磨法的1／24。

圖4 不同提取方法對(duì)不同藻類Chla濃度測(cè)定結(jié)果的影響Fig.4 Effects of extraction methods on measured Chla concentrations of threem icroalgae

2.3 不同提取時(shí)間對(duì)Chla濃度測(cè)定結(jié)果的影響

結(jié)果顯示，不同提取時(shí)間對(duì)牟氏角毛藻Chla的測(cè)定結(jié)果有顯著影響（圖5）。提取12 h的Chla濃度顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05），提取6 h的Chla濃度則顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05），24～96 h的Chla濃度無顯著差異。

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)牟氏角毛藻Chla濃度測(cè)定結(jié)果的影響Fig.5 Effects of extraction time on measured Chla concentrations of C.muelleri

2.4 樣品保存時(shí)間對(duì)Chla濃度測(cè)定結(jié)果的影響

結(jié)果顯示，隨著樣品保存時(shí)間的延長(zhǎng)，Chla濃度的測(cè)定結(jié)果逐漸降低（圖6），冷凍保存7 d后即出現(xiàn)顯著降低（P＜0.05）；但在7～30 d之間，Chla濃度的測(cè)定結(jié)果無顯著差異；樣品保存60 d后Chla濃度的測(cè)定結(jié)果極顯著降低（P＜0.01）。

圖6 不同樣品保存時(shí)間對(duì)牟氏角毛藻Chla濃度測(cè)定結(jié)果的影響Fig.6 Effects of sam p le preservation tim e on measured Chla concentrations of C.muelleri

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，玻璃纖維濾膜在加入3種抽提劑后保持完整，測(cè)定的Chla濃度結(jié)果也相對(duì)穩(wěn)定?；旌侠w維素濾膜加入抽提介質(zhì)后易造成液體渾濁，影響比色結(jié)果，有機(jī)系的聚偏氟乙烯濾膜則過濾速度較慢，不適合大量樣品分析。寧修仁［13］報(bào)道，使用Whatman GF／C玻璃纖維濾膜加碳酸鎂，測(cè)定海水浮游植物Chla濃度效果最佳。這是因?yàn)樘妓徭V具有防止葉綠素分解的作用，而玻璃纖維濾膜在丙酮中的不可溶性，提高了比色測(cè)定的準(zhǔn)確性。林少君等［11］使用醋酸纖維濾膜、微孔濾膜和GF／F玻璃纖維濾膜抽濾微囊藻水樣，發(fā)現(xiàn)各濾膜對(duì)Chla濃度測(cè)定結(jié)果影響不顯著。但吳妹英［14］報(bào)道，使用玻璃纖維濾膜測(cè)得的Chla濃度顯著高于使用醋酸纖維素濾膜和微孔濾膜測(cè)得的結(jié)果。結(jié)合本文實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，可以認(rèn)為玻璃纖維濾膜比較適宜海水Chla濃度分析。

本實(shí)驗(yàn)中，使用丙酮凍融法提取的蛋白核小球藻Chla濃度測(cè)定結(jié)果大幅低于乙醇和甲醇，表明丙酮對(duì)蛋白核小球藻Chla的提取效果不好。已有研究表明，丙酮對(duì)柵藻、小球藻、微擬球藻等綠藻的提取效果不佳［8－9，15］。研究表明，綠藻和藍(lán)藻中Chla較難提取，通常需要機(jī)械破碎細(xì)胞［16－17］。本研究中，蛋白核小球藻經(jīng)研磨后測(cè)定結(jié)果大幅提高，應(yīng)與此有關(guān)。但對(duì)同屬綠藻門的亞心形扁藻，丙酮凍融和研磨提取的Chla濃度無顯著性差異，表明丙酮對(duì)Chla的提取效果有種間差異。我國(guó)沿海海水中浮游植物主要為硅藻和甲藻［18－20］，采用丙酮作為提取溶劑對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大。但如果因環(huán)境條件改變導(dǎo)致海水中小球藻等綠藻的含量升高，凍融法會(huì)造成測(cè)定結(jié)果偏低。在養(yǎng)殖池塘水體中，綠藻占比較高［21－23］，在對(duì)其進(jìn)行養(yǎng)殖環(huán)境的監(jiān)測(cè)時(shí)，應(yīng)注意丙酮提取方法可能導(dǎo)致的結(jié)果差異。

小球藻Chla濃度測(cè)定結(jié)果表明，乙醇提取效果優(yōu)于甲醇和丙酮。不同提取劑的提取效果也與藻類種類有關(guān)［24－25］。陳紀(jì)新等［26］報(bào)道，丙酮、甲醇和乙醇對(duì)鹽生杜氏藻（Dunaliellasalina）、角毛藻（Chaetocerossp.）、赫胥黎艾氏藻（Emilliania huxleyi）的Chla提取效果無顯著性差異。WASMUND等［27］發(fā)現(xiàn)乙醇對(duì)于以甲藻和硅藻為主的海水Chla的提取效果優(yōu)于丙酮。但ROIJACKERS［28］報(bào) 道 丙 酮 對(duì) 阿 氏 顫 藻（Oscillatoriaagardhii）、美麗團(tuán)藻（Volvoxaureus）和Pennales目硅藻的提取效果比乙醇好，3種藻之間無差異。甲醇對(duì)銅綠微囊藻（Microcystisaeruginosa）Chla的提取效果優(yōu)于丙酮和乙醇［29］。但甲醇可部分融解混合纖維素濾膜，形成凝膠狀顆粒懸濁，干擾測(cè)定結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，對(duì)于玻璃纖維濾膜和聚偏氟乙烯濾膜，離心轉(zhuǎn)速對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大。

一般來說，研磨破碎細(xì)胞可提高Chla的提取率［27，30］。本實(shí)驗(yàn)中，凍融法測(cè)定的亞心形扁藻和牟氏角毛藻Chla濃度卻高于研磨法。此前也有研究表明，凍融法測(cè)定Chla濃度的結(jié)果高于研磨法［11，31］。這可能是因?yàn)榉磸?fù)凍融法是利用細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和細(xì)胞液濃度的增高引起溶脹來達(dá)到破損細(xì)胞壁的目的，而研磨操作步驟多，樣品轉(zhuǎn)移過程中可能造成損失，這應(yīng)該是造成研磨法測(cè)定結(jié)果偏低的原因［32］。林少君等［11］認(rèn)為，凍與融的時(shí)間比例大概為20 min∶5 min，融解時(shí)間最好不要超過10 min。本實(shí)驗(yàn)中凍、融時(shí)間分別為1 h、20 min，也取得了比較好的效果，說明凍融時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)結(jié)果影響不大。

不同提取時(shí)間的結(jié)果顯示，提取12 h的Chla濃度測(cè)定值最高，這與GB 17378.7 2007和HJ 897 2017標(biāo)準(zhǔn)一致。吳妹英［14］也發(fā)現(xiàn)，4℃下提取16 h，Chla濃度值趨于穩(wěn)定，而24 h后，Chla濃度值緩慢下降。有研究報(bào)道［33－34］，升高溫度可縮短Chla的提取時(shí)間?？紤]到操作簡(jiǎn)便性，建議Chla的提取時(shí)間為12 h以上、不超過24 h。

在實(shí)際的海洋調(diào)查監(jiān)測(cè)工作中，經(jīng)常遇到因條件所限無法現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定，導(dǎo)致水樣抽濾后保存時(shí)間較長(zhǎng)的問題。王秋麗［35］報(bào)道，冷凍保存7～14 d后，Chla損失約15%，冷凍保存30 d后，Chla損失約20%。本實(shí)驗(yàn)中，樣品冷凍保存15 d后Chla損失7%，保存30 d后損失12%，而保存60 d后損失高達(dá)22%。因此，水樣抽濾后，最好在15 d內(nèi)完成測(cè)量，以確保監(jiān)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上，在測(cè)定不同藻類的葉綠素a含量時(shí)，采用玻璃纖維濾膜過濾水樣、凍融法提取12～24 h后測(cè)定效果最好，水樣抽濾后保存時(shí)間不宜超過15 d，對(duì)蛋白核小球藻應(yīng)采用研磨法提取Chla。

致謝：本實(shí)驗(yàn)得到溫州大學(xué)馬增嶺老師和上海海洋大學(xué)沈盎綠老師的指導(dǎo)，在此一并表示感謝。