羅鵬飛，王金泉

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

牛結(jié)核病(Bovine tuberculosis)是由牛結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的一類人獸共患傳染病，其主要傳播途徑是呼吸道和消化道[1-2]。由于牛結(jié)核分支桿菌擁有廣泛的宿主，尤其是牛只；如若病牛產(chǎn)生的牛奶未經(jīng)消毒就被人類飲用，則有較大幾率感染該病，同樣，人類染病也可以經(jīng)接觸等途徑傳染給牛。對人結(jié)核病的發(fā)病原因統(tǒng)計，10%以上的原因都是由牛分枝桿菌導(dǎo)致[3-5]。該病在世界各地均有發(fā)生，且一年四季都可感染[6]；是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定通報的疫病，也是我國的二類疫病[7]。該疾病是國內(nèi)外迫切需要解決的嚴(yán)重公共安全問題。

為有效控制牛結(jié)核病的流行，對新疆阿勒泰地區(qū)開展了結(jié)核病凈化工作。為了解該地區(qū)結(jié)核病的防控效果，通過對2015-2019年連續(xù)5年的牛結(jié)核病流行病學(xué)監(jiān)測，以期通過該數(shù)據(jù)制定更為精確的防控手段，為該地區(qū)的凈化工作提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2015-2019年，在阿勒泰地區(qū)8個鄉(xiāng)鎮(zhèn)共計采集樣品64 442份。

1.2 檢測試劑 提純牛型結(jié)核菌素：哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；牛結(jié)核γ-干擾素ELSIA檢測試劑盒：青島瑞爾生物技術(shù)有限公司；DNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker：TaKaRa 公司；2×EcoTaqPCR SuperMix：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 檢測方法 采樣數(shù)據(jù)從2015年開始統(tǒng)計，先對該年份的所有牛只進(jìn)行牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)(PPD)普檢，將陽性牛、可疑牛只采集抗凝血，可疑牛只進(jìn)行二次檢測，二次檢測仍為可疑則定為陰性。通過PPD檢測結(jié)果，隨機(jī)采集部分陰性牛血液，與陽性牛及二次檢測均為可疑牛只的抗凝血進(jìn)行牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試驗和PCR檢測，并對結(jié)果進(jìn)行分析，選擇特異性最優(yōu)的檢測方法對2016-2019年采集的牛進(jìn)行結(jié)核病檢測。

1.3.1 牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)(PPD) 按照國標(biāo)《動物結(jié)核病診斷技術(shù)》(GB/T18645-2002)[8]進(jìn)行，分別于注射前和注射后12、24 h和72 h測量皮膚厚度，并計算出皮厚差，按國標(biāo)統(tǒng)計PPD結(jié)果。

1.3.2 牛結(jié)核γ-干擾素 ELISA 試驗 采集抗凝血24 h內(nèi)送回實驗室，按照說明書進(jìn)行檢測。

1.3.3 PCR方法檢測 將抗凝血按照DNA提取試劑盒說明書提取DNA，PCR參照段旭基等[9]牛結(jié)核桿菌和結(jié)核分枝桿菌IS1081基因(IS-1：5′-CGACGCTCTGACCGACAAACT-3′；IS-2：5′-TGCTTGGCGGGTTCTTCG-3′；324 bp)擴(kuò)增目的片段；PCR擴(kuò)增體系為：95 ℃ 5 min；(94 ℃，2 min；58 ℃，1.5 min；72 ℃，2 min)35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR擴(kuò)增結(jié)果陽性產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，用NCBI提供的BLAST軟件進(jìn)行比對分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析 文中Kappa系數(shù)計算公式如下：

其中，Po為觀察符合率，Pe為機(jī)遇符合率。

2 結(jié)果

2.1 3種試驗方法的符合分析 用PPD試驗對12 115頭牛進(jìn)行普檢，對可疑牛只進(jìn)行復(fù)檢，最終確定25頭牛為陽性牛，3頭二次結(jié)果均為可疑品。陽性牛未表現(xiàn)出明顯臨床癥狀。隨機(jī)抽取陰性牛血樣131份(包括二次結(jié)果均為可疑的3個樣品)，總計156份樣品，進(jìn)行牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試驗和PCR檢測。

經(jīng)IS1081基因引物擴(kuò)增后，共有27份牛血DNA中擴(kuò)增出目的片段，約324 bp，大小符合預(yù)測值(圖1)，經(jīng)測序比對，確認(rèn)為牛結(jié)核桿菌。

圖1 牛結(jié)核桿菌 IS1081基因序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of IS1081 gene of bovine tuberculosisM：DL-2 000 DNA Marker；1～5：牛結(jié)核桿菌樣本；6：陽性對照；7：陰性對照M：DL-2 000 DNA Marker；1～5:Samples of Mycobacterium bovis tuberculosis;6:Positive control;7:Negative control

表1 PCR方法、γ-干擾素 ELISA方法與PPD方法檢測結(jié)果Table 1 Results of PCR,γ-interferon ELISA and PPD

PCR檢測出陽性27份，陰性129份，陽性率為17.31%；PPD檢測陽性為25份，陰性131份，陽性率為16.03%，Kappa值為0.83。γ-干擾素ELISA檢測陽性26份，陰性130份，陽性率為16.67%，Kappa值為0.88。Kappa≥0.8，檢驗結(jié)果一致性很好。綜合分析，最終決定用PCR方法進(jìn)行2016-2019年的流行病學(xué)調(diào)查。

對阿勒泰地區(qū)2015-2019年牛結(jié)核病檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計。從2015-2019年試驗結(jié)果(表2) 可看出，牛結(jié)核病總平均陽性率為0.18%，從2015年的0.22%降至2019年的0.09%；其中，2015年陽性檢出率最高，達(dá)到0.22%(27/12 155)。此次結(jié)果表明，近5年阿勒泰地區(qū)牛結(jié)核病陽性率呈現(xiàn)下降趨勢。

表2 2015-2019年牛結(jié)核病檢測結(jié)果Table 2 Test results of bovine tuberculosis in 2015-2019

2.2 不同地區(qū)牛結(jié)核病監(jiān)測結(jié)果 對該地區(qū)5年間的不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)牛結(jié)核病進(jìn)行統(tǒng)計(見表3)。從表3可以看出，5年內(nèi)共計調(diào)查64 442頭牛，陽性114頭，平均陽性率為0.18%。其中，C鄉(xiāng)鎮(zhèn)的陽性率為0.02%(1/6 531)；其余鄉(xiāng)鎮(zhèn)陽性率分別為A(0.25%，20/8 125)、B(0.18%，14/7 988)、D(0.16%，15/9 217)、E(0.22%，23/10 336)、F(0.13%，7/5 475)、G(0.19%，16/8 512)及H(0.22%，18/8 258)。此次檢測結(jié)果表明，阿勒泰地區(qū)8個鎮(zhèn)(鄉(xiāng))牛結(jié)核病防控效果存在明顯差異。除C鄉(xiāng)鎮(zhèn)(0.02%)外，其余7個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的陽性率均高于農(nóng)業(yè)部凈化標(biāo)準(zhǔn)(0.05%)，防控形勢依然嚴(yán)峻。

表3 2015-2019年不同地區(qū)牛結(jié)核病監(jiān)測結(jié)果Table 3 Results of bovine tuberculosis in different regions from 2015 to 2019

3 討論

牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)(PPD)是國際推薦的診斷方法。其優(yōu)點是該方法對人員的專業(yè)水平要求低，簡單培訓(xùn)就能操作[10]，且結(jié)核菌素抗原便宜，易于推廣；但是該方法操作步驟繁瑣，耗時耗力，非特異性反應(yīng)經(jīng)常出現(xiàn)，重復(fù)性不好。γ-干擾素 ELISA 試驗可以檢測早期感染牛只，特異性較好，易于標(biāo)準(zhǔn)化；但是γ-干擾素ELISA試驗需在采血后24 h內(nèi)檢測[11]，且試劑盒的成本較高。PCR方法同樣具有高敏感性和強(qiáng)特異性，尤其是一些臨床癥狀不明顯的隱性感染等[9,12]；且牛分枝桿菌IS1081具有高度的種屬特異性；PCR檢測的重復(fù)性較好，人為因素相對較小。目前，PPD仍為我國檢疫標(biāo)準(zhǔn)，其他方法都是輔助手段，但是在實際操作中，可以根據(jù)實際情況靈活選擇。本試驗經(jīng)綜合考慮，采用PCR方法對2016-2019年牛結(jié)核病進(jìn)行結(jié)核病檢測，掌握阿勒泰地區(qū)牛結(jié)核病流行情況和分布特點。

2015-2019年阿勒泰地區(qū)牛結(jié)核病總陽性率為0.18%，且每年呈下降趨勢；該病的下降趨勢主要與采取強(qiáng)制撲殺陽性病牛政策措施有關(guān)。此數(shù)據(jù)與蓋守睿對2009-2013年的監(jiān)控數(shù)據(jù)相似[13]。近年來，阿勒泰地區(qū)獸醫(yī)部門高度重視，不斷增加經(jīng)費投入，提高撲殺補助標(biāo)準(zhǔn)，強(qiáng)制撲殺陽性牛，并將尸體及相關(guān)產(chǎn)品無害化處理，切斷傳染源，對快速凈化牛結(jié)核病起到了至關(guān)重要的作用。從監(jiān)測結(jié)果來看，自2019年防控措施加強(qiáng)后，陽性率有了明顯的下降，雖未達(dá)到農(nóng)業(yè)部凈化標(biāo)準(zhǔn)(0.05%)，但防控措施仍然不可懈怠，應(yīng)引起密切關(guān)注，防止疫病反彈。

對阿勒泰地區(qū)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)牛結(jié)核病監(jiān)測結(jié)果來看，7個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的陽性率均高于農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)，不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)間牛結(jié)核病防控效果存在明顯差異，可能是由于該數(shù)據(jù)是一個綜合數(shù)據(jù)，為5年間該地區(qū)的總感染率，且調(diào)查樣品來自不同規(guī)模的養(yǎng)殖場，各養(yǎng)殖場的防控意識有所差別，故不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的防控結(jié)果存在區(qū)別。C鄉(xiāng)鎮(zhèn)的規(guī)模養(yǎng)殖場較多，且防控意識較高，故該地區(qū)5年僅發(fā)現(xiàn)1例陽性。而A鄉(xiāng)鎮(zhèn)自繁自養(yǎng)居多，且牲畜交易頻繁，應(yīng)加強(qiáng)該地的監(jiān)控及防控措施。

為今后有效控制凈化該病，相關(guān)部門應(yīng)不斷完善病牛的撲殺補償機(jī)制，增強(qiáng)該病的監(jiān)督和保障機(jī)制；并且加強(qiáng)動物檢疫工作，發(fā)現(xiàn)陽性病牛應(yīng)立即撲殺并做好無害化處理[14]。對外來牲畜的檢疫工作不容忽視，嚴(yán)禁感染牛只引入。由于結(jié)核病為人獸共患病，可與人結(jié)核病交叉感染，一定要增強(qiáng)畜主的防范意識，避免交叉感染。