侯敏娜,侯少平,吳滿芳，劉艷紅，彭修娟，許海燕

(1．陜西國際商貿(mào)學(xué)院,陜西 咸陽 712046；2.都昌縣第二人民醫(yī)院，江西 九江332600)

百合(Liliumbrownii)為百合科百合屬植物卷丹的干燥肉質(zhì)鱗葉[1]，味甘性寒，歸心肺二經(jīng)，具有較高的食用和藥用價(jià)值。百合含有多糖、甾體皂甙、酚類化合物、黃酮類化合物和生物堿等多種活性成分，其中多糖含量較高[2-3]，用于治療咳嗽痰多、心煩驚悸、失眠等癥[4-6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，百合在抗疲勞、抗抑郁、抗腫瘤、降血糖、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、止咳等[7-10]方面有很好的療效。植物多糖的提取方法主要有溶劑法、酶法、超聲輔助法、微波法等。作者采用超聲輔助法提取百合多糖，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以液料比、提取時(shí)間、超聲功率、提取次數(shù)為考察因素，以百合多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化百合多糖的提取工藝，以期為百合多糖的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

百合，購于甘肅蘭州中藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)陜西國際商貿(mào)學(xué)院中藥教研室雷國蓮教授鑒別為百合科百合屬植物卷丹。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)2014041)，中國藥品生物制品鑒定所；濃硫酸，天津化學(xué)試劑有限公司；苯酚，天津盛奧化學(xué)試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

KQ5200DE型超聲波提取儀，昆山超聲儀器有限公司；TGL-15B型離心機(jī)，上海安平科學(xué)儀器廠；TU-1810型紫外分光光度計(jì)，上海長城制造有限公司；YP20002型電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 百合多糖的提取及精制

將干燥的百合藥材切成小片，置于干凈的燒杯中，按一定液料比加入適量蒸餾水，浸泡1 h。將浸泡液超聲提取后，抽濾，濾液濃縮至原溶液體積的1/4，加入4倍體積的95%乙醇，靜置過夜，沉淀即為百合粗多糖。將百合粗多糖加入氯仿-正丁醇混合液中，采用Sevag法[11-12]除去蛋白質(zhì)，即得精制后的百合多糖。

1.3 百合多糖得率的測(cè)定

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品置于105 ℃干燥箱中干燥至恒重，精密稱取0.005 0 g，置于50 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于20 mL容量瓶中，加蒸餾水至2 mL；再加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻，40 ℃水浴加熱30 min，取出，冰水冷卻10 min；另取2.0 mL蒸餾水作空白對(duì)照；測(cè)定490 nm處吸光度。以葡萄糖濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 百合多糖得率的計(jì)算

將百合多糖置于60 ℃干燥箱中干燥后，精密稱取4 mg，置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得樣品溶液。精密吸取樣品溶液1 mL，按1.3.1方法測(cè)定百合多糖在490 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖濃度，按下式計(jì)算百合多糖得率(Y)[13-14]：

式中：c為多糖濃度， mg·mL-1；V為溶液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為百合質(zhì)量，mg。

1.4 百合多糖超聲輔助提取工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，mL∶g，下同)、提取時(shí)間(3 min、4 min、5 min、6 min、7 min)、超聲功率(300 W、400 W、500 W、600 W、700 W)、提取次數(shù)(1次、2 次、3 次)對(duì)百合多糖得率的影響，確定各因素的適宜范圍[15-19]。

1.4.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以百合多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以液料比(A)、提取時(shí)間(B)、超聲功率(C)、提取次數(shù)(D)為考察因素進(jìn)行4因素3水平Box-Behnken實(shí)驗(yàn),設(shè)計(jì)29組響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

擬合得葡萄糖的線性回歸方程為：A=0.9703c+0.0175，R2=0.9982。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 液料比對(duì)百合多糖得率的影響

在超聲功率為400 W、提取時(shí)間為5 min、提取2次的條件下，考察液料比對(duì)百合多糖得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 液料比對(duì)百合多糖得率的影響Fig.2 Effect of liquid-soild ratio on yield of Lilium brownii polysaccharides

由圖2可以看出，隨著液料比的增大，即提取溶劑用量的增加，百合多糖得率先升高后降低，當(dāng)液料比為20∶1時(shí)，百合多糖得率達(dá)到最高，為1.97%。可以初步推斷，溶劑用量過少時(shí)，多糖不能充分溶出；溶劑用量過多時(shí)，會(huì)引入更多的雜質(zhì)，導(dǎo)致多糖得率降低。故選擇20∶1為液料比的中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)百合多糖得率的影響

在超聲功率為400 W、液料比為20∶1、提取2次的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)百合多糖得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)百合多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of Lilium brownii polysaccharides

由圖3可以看出，隨著提取時(shí)間的延長,百合多糖得率先升高后降低，當(dāng)提取時(shí)間為4 min時(shí)，百合多糖得率達(dá)到最高，為1.93%。提取時(shí)間較短(少于4 min)時(shí)，提取不完全，多糖得率低；當(dāng)提取時(shí)間較長(超過4 min)時(shí)，多糖結(jié)構(gòu)可能被破壞，使得多糖含量減少。故選擇4 min為提取時(shí)間的中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。

2.2.3 超聲功率對(duì)百合多糖得率的影響

在液料比為20∶1、提取時(shí)間為4 min、提取2次的條件下，考察超聲功率對(duì)百合多糖得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲功率對(duì)百合多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on yield of Lilium brownii polysaccharides

由圖4可以看出，隨著超聲功率的增大,百合多糖得率先升高后降低而后趨于穩(wěn)定，當(dāng)超聲功率為400 W時(shí)，百合多糖得率達(dá)到最高，為1.98%。可能是因?yàn)?，超聲功率較小時(shí)，超聲波能量較低，不能有效提取多糖；當(dāng)超聲功率過大時(shí)，一些非糖物質(zhì)也被提取出來，影響多糖測(cè)定，致使多糖得率降低。故選擇400 W為超聲功率的中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)百合多糖得率的影響

在液料比為20∶1、提取時(shí)間為4 min、超聲功率為400 W的條件下，考察提取次數(shù)對(duì)百合多糖得率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 提取次數(shù)對(duì)百合多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction times on yield of Lilium brownii polysaccharides

由圖5可以看出，百合多糖得率在超聲提取2次時(shí)達(dá)到最高，為2.96%，超過2次后明顯下降?？赡苁怯捎冢B續(xù)2次的提取使多糖的結(jié)構(gòu)被破壞或者物料的水溶液變得黏稠，多糖溶出困難。故選擇2次為提取次數(shù)的中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(表2)

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.2 回歸模型的建立和方差分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到多元二次回歸模型方程為：Y=12.76+0.38A+0.72B+0.17C+0.28D-0.14AB-0.25AC+0.57AD+0.81BC-0.13BD+0.060CD-0.35A2-0.084B2-0.81C2-1.49D2。

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析

即該模型可以解釋 93.58%響應(yīng)值的變化，模型擬合程度較好，說明該模型可以對(duì)不同條件下百合多糖得率進(jìn)行預(yù)測(cè)。此外，提取時(shí)間的一次項(xiàng)和提取次數(shù)的二次項(xiàng)高度顯著，提取時(shí)間和超聲功率的交互項(xiàng)、超聲功率的二次項(xiàng)極顯著。由F值可以得出各因素影響百合多糖得率的大小依次為：提取時(shí)間(B)>液料比(A)>提取次數(shù)(D)>超聲功率(C)。

2.3.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸分析結(jié)果，使用Design-Expert 8.0.6軟件繪制各因素交互作用對(duì)百合多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖，結(jié)果見圖6。

由圖6a可以看出，液料比與提取時(shí)間的響應(yīng)曲面均向下彎曲，但液料比的彎曲程度更大，表明液料比的二次項(xiàng)對(duì)百合多糖得率影響更大。確定兩因素最佳水平參數(shù)范圍：液料比(15～20)∶1、提取時(shí)間3～4 min,在此范圍內(nèi)百合多糖得率最高。

圖6 各因素交互作用對(duì)百合多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface map and contour map for effect of interaction between each factor on yield of Lilium brownii polysaccharides

由圖6b可以看出，液料比與超聲功率的響應(yīng)曲面均向下彎曲，超聲功率的彎曲程度更大，表明超聲功率的二次項(xiàng)對(duì)百合多糖得率的影響更大。確定兩因素最佳水平參數(shù)范圍為：液料比(20～30)∶1、超聲功率400～500 W，在此范圍內(nèi)百合多糖得率最高。

由圖6c可以看出，液料比與提取次數(shù)的響應(yīng)曲面均向下彎曲，提取次數(shù)的坡度更陡，表明提取次數(shù)的二次項(xiàng)對(duì)百合多糖得率的影響較大。等高線呈橢圓形，二者的交互作用顯著。確定兩因素最佳水平參數(shù)范圍為：液料比(20～30)∶1、提取次數(shù)2～3次，在此范圍內(nèi)百合多糖得率最高。

由圖6d可以看出，提取時(shí)間與超聲功率的響應(yīng)曲面均向下彎曲，超聲功率的彎曲程度更大，表明超聲功率的二次項(xiàng)對(duì)百合多糖得率的影響更大。等高線呈橢圓形，二者的交互項(xiàng)顯著。確定兩因素最佳水平參數(shù)范圍為：超聲功率400～500 W、提取時(shí)間3～4 min，在此范圍內(nèi)百合多糖得率最高。

由圖6e可以看出，提取時(shí)間與提取次數(shù)的響應(yīng)曲面都有彎曲，兩者對(duì)百合多糖的得率均有影響，提取次數(shù)的彎曲程度更大，故對(duì)百合多糖得率的影響更大。等高線接近圓形，二者的交互作用不顯著。確定兩因素最佳水平參數(shù)范圍為：提取時(shí)間3～4 min、提取次數(shù)2～3次，在此范圍內(nèi)百合多糖得率最高。

由圖6f可以看出，超聲功率與提取次數(shù)的響應(yīng)曲面均向下彎曲，提取次數(shù)的坡度更陡，說明提取次數(shù)的二次項(xiàng)對(duì)百合多糖得率的影響更大。等高線呈橢圓形，二者的交互作用顯著。確定兩因素最佳水平參數(shù)范圍為：提取功率400～500 W、提取次數(shù)2～3次，在此范圍內(nèi)百合多糖得率最高。

2.4 工藝驗(yàn)證

通過響應(yīng)面法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到百合多糖的最佳超聲輔助提取工藝為：液料比20.5∶1、提取時(shí)間4.3 min、超聲功率400 W、提取次數(shù)2次，百合多糖預(yù)測(cè)得率為13.150%?？紤]實(shí)際操作情況，將最佳超聲輔助提取工藝修正為：液料比21∶1、提取時(shí)間4 min、超聲功率400 W、提取次數(shù)2次。在此條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，百合多糖平均得率為12.936%，與百合多糖得率預(yù)測(cè)值(13.150%)接近。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以液料比、提取時(shí)間、超聲功率、提取次數(shù)為考察因素，以百合多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了百合多糖的超聲輔助提取工藝。確定最佳提取工藝為：液料比21∶1 (mL∶g)、提取時(shí)間4 min、超聲功率400 W、提取次數(shù)2次，在此條件下，百合多糖得率為12.936%，與預(yù)測(cè)值(13.150%)相差0.214%。