陳 順，崔莉莉,2，高守紅，陸文銓，宋江麗，王志鵬 （. 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200003；2. 宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000）

口腔潰瘍膜是海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院的特色院內(nèi)制劑，該制劑主要由克霉唑、硫酸新霉素、冰片、鹽酸達克羅寧、地塞米松磷酸鈉等成分組成，呈微黃色至淡黃色半透明膜。臨床用于治療多發(fā)性口腔潰瘍。潰瘍是口腔疾病的常見表現(xiàn)，口腔黏膜潰瘍病因可分為4 類：感染性、免疫性、外傷性和腫瘤性[1]。地塞米松磷酸鈉屬糖皮質(zhì)激素，經(jīng)常用于加速潰瘍愈合、減輕口腔潰瘍的局部癥狀[2]；克霉唑是一種常用于治療真菌感染的抗真菌藥物[3]。口腔潰瘍膜能保護局部潰瘍面，延長局部作用時間、提高藥物濃度，具有定位釋放、使用方便等優(yōu)點[4]。本制劑室唐蕾等[5]通過測定口腔潰瘍膜中克霉唑和地塞米松磷酸鈉的含量建立了一套操作簡單、準確性好的HPLC 含量測定方法，適用于口腔潰瘍膜的質(zhì)量標準控制。但隨著制劑標準的提高，在《軍隊醫(yī)療機構(gòu)制劑許可證》驗收細則中明確規(guī)定：配制制劑的原料藥應(yīng)符合法定藥品標準，輔料及直接接觸制劑的包裝材料應(yīng)符合法定標準。因此，一些原料藥及輔料在更換藥用標準后，按照原先的樣品前處理方法測得的含量一直偏低。本文以口腔潰瘍膜中主要有效成分地塞米松磷酸鈉和克霉唑的含量為指標，對口腔潰瘍膜中有效成分的提取工藝進行研究，并進一步優(yōu)化地塞米松磷酸鈉和克霉唑的含量測定方法。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent 1 260 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）：包含G7104C（四元泵）輸液泵，G7129C 自動進樣器，G7116A 柱溫箱，G7115A DAD 檢測器；色譜柱為Agilent Zobax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Agilent 公司）；Sartorius 天平（型號：BSA124S-CW,十萬分之一天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；超聲儀（SK7200H 型，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；Eppendorf 移液器（德國）；WL-901 Vortex 旋渦振蕩混和器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試劑與藥品

地塞米松磷酸鈉對照品（批號：ZN1107XA）、克霉唑?qū)φ掌罚ㄅ枺篐01S9Z68980），購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純，德國Fisher 公司）；娃哈哈純凈水（純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司）；磷酸二氫鉀等其余試劑均為分析純?？谇粷兡ぃㄅ枺?90919、190923、190926，每片含地塞米松磷酸鈉0.4 mg，克霉唑6.53 mg，海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院制劑中心自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zobax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（70∶30, 用磷酸溶液調(diào)pH 值4.4～4.5）；紫外檢測波長：230 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；采集時間：30 min，進樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液

精密稱取地塞米松磷酸鈉16.328 mg 置于10 ml量瓶中，加甲醇-水（7∶3）溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為1.632 8 mg/ml 的地塞米松磷酸鈉對照品儲備液。精密稱取克霉唑?qū)φ掌?0.058 mg 置于10 ml 量瓶中，加甲醇-水（7∶3）溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為2.005 8 mg/ml 的克霉唑?qū)φ掌穬湟骸?/p>

2.2.2 混合對照品溶液

分別精密量取地塞米松磷酸鈉、克霉唑?qū)φ掌穬湟哼m量，加甲醇-水（7∶3）配制成含地塞米松磷酸鈉16.328 μg/ml 和克霉唑200.58 μg/ml 的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液

取口腔潰瘍膜剪成3～5 mm 大小的碎片，精密稱取樣品0.2 g，置于100 ml 容量瓶中，加入30 ml水，超聲30 min，取出，放冷，加入甲醇并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 陰性對照品溶液

參照本課題組前期實驗方法，制備陰性對照品溶液[5]。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗

分別取混合對照品溶液（地塞米松磷酸鈉、克霉唑）和供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。圖中顯示供試品溶液中地塞米松磷酸鈉和克霉唑保留時間與對照品溶液相應(yīng)色譜峰的保留時間一致。地塞米松磷酸鈉和克霉唑與其相近的其他峰分離完全（分離度＞1.5），即本試驗條件下地塞米松磷酸鈉和克霉唑與其他組分分離完全。

2.3.2 線性關(guān)系的考察

精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，稀釋成以下濃度的混合對照品溶液：地塞米松磷酸鈉0.482 0、0.816 4、1.632 8、4.082 0、8.164 0、16.328 0 μg/ml；克霉唑5.014 5、10.029 0、20.058 0、50.14 50、100.290 0、200.580 0 μg/ml，按“2.1”項下色譜條件進行測定，并記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（C），繪制標準曲線，并進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 地塞米松磷酸鈉和克霉唑的線性關(guān)系考察

2.3.3 精密度試驗

取同一批口腔潰瘍膜（批號：190919），按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進行測定，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。計算地塞米松磷酸鈉和克霉唑峰面積RSD 分別為0.65%和0.33%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗

取同一批口腔潰瘍膜（批號：190919），按“2.2.3”項方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進行測定，記錄峰面積。計算地塞米松磷酸鈉和克霉唑峰面積RSD 分別為0.56%和0.54%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗

取同一批口腔潰瘍膜（批號：190919），按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別在0、2、4、6、12、24 h 進樣測定，記錄峰面積。計算地塞米松磷酸鈉和克霉唑峰面積RSD 值分別為0.94%和1.33%，表明供試品溶液在室溫放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：190919）0.2 g，共6 份，置于100 ml 容量瓶中，加入各對照品適量，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果地塞米松磷酸鈉和克霉唑的平均加樣回收率分別為（103.97±1.02）%和（104.23±0.63）%，表明本法回收率良好。

2.3.7 樣品含量測定

取3 批口腔潰瘍膜，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進行測定，計算樣品中地塞米松磷酸鈉和克霉唑的含量，結(jié)果見表2。

表2 口腔潰瘍膜中地塞米松磷酸鈉和克霉唑的含量測定結(jié)果(n=3, ±s)

表2 口腔潰瘍膜中地塞米松磷酸鈉和克霉唑的含量測定結(jié)果(n=3, ±s)

含量[標示量（%）]地塞米松磷酸鈉 克霉唑190 919 76.600 0±0.005 2 86.800 0±0.011 3 190 923 85.900 0±0.011 5 99.100 0±0.025 9 190 926 74.900 0±0.043 7 85.700 0 ±0.067 6批號

3 討論

3.1 提取方法的優(yōu)化

本研究根據(jù)口腔潰瘍膜的特性，對溶劑種類、溶劑提取順序進行考察，由于口腔潰瘍膜中含羧甲基纖維素鈉，這是由一種天然纖維素衍生的陰離子水溶性聚合物[6]，易溶于水，因此需要一定比例的水將膜劑破壞，才能釋放出膜劑中的有效成分地塞米松磷酸鈉和克霉唑。

3.1.1 甲醇超聲提取

取口腔潰瘍膜剪成3～5 mm 大小的碎片，精密稱取樣品0.2 g，置于100 ml 容量瓶中，加入甲醇35 ml，超聲30 min，取出，放冷，加入15 ml 水，混勻后用甲醇-水（7∶3）定容，搖勻，即得。

3.1.2 水超聲提取

取口腔潰瘍膜剪成3～5 mm 大小的碎片，精密稱取樣品0.2 g，置于100 ml 容量瓶中，加入30 ml水，超聲30 min，取出，放冷，加入甲醇并稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.1.3 以70%甲醇超聲提取

取口腔潰瘍膜剪成3～5 mm 大小的碎片，精密稱取樣品0.2 g，置于100 ml 容量瓶中，加入甲醇-水（7∶3）30 ml，超聲30 min，取出，放冷，加入甲醇-水（7∶3）稀釋至刻度，搖勻，即得。

用以上不同溶劑提取口腔潰瘍膜，每份樣品、每種溶劑平行提取3 次，按“2.1”項所述色譜條件測定地塞米松磷酸鈉和克霉唑含量，結(jié)果見表3。實驗結(jié)果顯示：水超聲提取和70%甲醇超聲提取對口腔潰瘍膜中有效成分的提取效果相當(dāng)，但水超聲提取相對簡單，故選用水超聲提取30 min 為最佳提取工藝。

3.2 流動相pH 的優(yōu)化

在液相色譜條件優(yōu)化實驗中，比較了不同pH 時的采集時間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：pH 在4.4～4.5 時采集時間為30 min，較之于前縮短了5 min，方法更便捷。

本研究基于HPLC 同時測定口腔潰瘍膜中地塞米松磷酸鈉、克霉唑含量的方法，經(jīng)提取工藝的優(yōu)化和全面的方法學(xué)考察，成功用于測定樣品中地塞米松磷酸鈉和克霉唑的含量，該法簡便可靠，可為口腔潰瘍膜的質(zhì)量控制提供依據(jù)，也為其質(zhì)量標準研究奠定了基礎(chǔ)。