李浩明，洪穩(wěn)穩(wěn)，張成中，魯 輪，周建理 （. 國家中藥材產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，安徽 亳州 26800；2. 亳州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，安徽 亳州 26800；. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 20000；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海200；. 安徽省質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化研究院，安徽 合肥 200）

顯微鑒定是中藥鑒定中利用顯微技術(shù)對中藥進(jìn)行顯微分析，以確定其品種和質(zhì)量的一種常用鑒定方法，顯微制片是其主要的觀察對象。組織顯微鑒定則是中藥顯微鑒定最常用的方法之一[1-2]。對于一些動物、植物等組織片，徒手切片是其中最實用的方法之一[3]。使用傳統(tǒng)的方法需鑒定員具有很強(qiáng)的顯微觀察能力，更需操作者有扎實的切片功底。傳統(tǒng)的中藥顯微鑒定切片法是把干藥材清水泡軟，端在手上，用剃刀或刀片，快速地從水平方向由外向內(nèi)削下薄片[4-6]。這種切片方法的缺點(diǎn)是：藥材前處理耗時，處理軟硬程度不易掌握；操作時刀口下方?jīng)]有硬物抵托，藥材容易出現(xiàn)“讓”（在刀壓迫下彎曲）的情況，難以切到薄而完整的切片。由于傳統(tǒng)方法切片困難，導(dǎo)致許多實驗室不愿做此項目，故而選擇用石蠟切片[7]的方式制片觀察鑒定，而石蠟制片需要經(jīng)過蠟封、固化、切片、脫蠟等步驟，耗時較長[8]，相對來說不適合快速、準(zhǔn)確檢測中藥的要求，影響到藥典等標(biāo)準(zhǔn)的使用，基于上述原因，制定標(biāo)準(zhǔn)時在方法上多選擇比較容易操作的粉末制片，但粉末制片可以提供的比對信息明顯少于切片，影響了鑒定的效率和準(zhǔn)確性。冰凍切片技術(shù)是一種較為新穎的組織制片方法，它將生物組織置于低溫下，迅速凍結(jié)達(dá)到一定硬度后進(jìn)行切片。相對于常規(guī)的石蠟切片，無需經(jīng)過脫水、透明、浸蠟等步驟,組織不會收縮，易保持原有生物形態(tài), 具有快速、簡便、易操作等優(yōu)點(diǎn)，但新鮮植物細(xì)胞因具有液泡，含水量較大使得在進(jìn)行低溫切片時易形成冰晶，造成植物組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到傷害。又因為細(xì)胞壁的存在使得植物組織在冰凍后硬度變大易破碎，致使多數(shù)情況下難以切出結(jié)構(gòu)完整的切片,并且操作時需要快速冷凍設(shè)備及相適應(yīng)的冰凍切片機(jī)，因此該技術(shù)在植物組織切片上的應(yīng)用較少[9]。對于基層工作人員來說，如果能夠掌握一種更為簡單的切片操作方法，便可事半功倍。為此，筆者對傳統(tǒng)切片方法進(jìn)行了多方面的改革，建立了一種新的切片方法，稱之為立式快速徒手切片法，本實驗隨機(jī)選擇了亳州中藥材市場上幾種具有代表性的中藥材進(jìn)行切片操作，以對這一方法的可行性、精確性、操作性、實用性等進(jìn)行驗證。

1 儀器與材料

1.1 試驗儀器

顯微鏡（型號：德國徠卡DM2700P）；飛鷹刀片（上海吉列有限公司）；美工刀片（得力集團(tuán)）老式剃刀（揚(yáng)州天藝）。

1.2 材料

純凈水（自制）；水合氯醛、甘油（國藥集團(tuán)）。廣金錢草、降香、蔓荊子、山羊角、西河柳、地錦草、堿地蒲公英、益母草等（亳州中藥材市場）。

2 方法與結(jié)果

2.1 切片方法

傳統(tǒng)顯微切片材料的處理沿用了國外研究植物組織學(xué)的工作方法。多采用新鮮植物，即“軟”的材料。而中藥材的顯微鑒定，實驗材料是干質(zhì)藥材。把干質(zhì)材料用鋸或小刀做出切面，再用細(xì)紋鋼銼加以處理使之成平整的截面，藥材下墊木板（塑料板、鋼板、載玻片等硬質(zhì)平面），刀口蘸水（蘸水可防止切片滑落）。刀片立起快速切下，切出薄片，切片不黏連（圖1A）。

2.2 藥材處理

廣金錢草、西河柳、地錦草、堿地蒲公英等脆質(zhì)的葉類、草質(zhì)莖類藥材，水浸10 s 后，紙巾壓平，處理至微軟，進(jìn)行切片操作。蔓荊子、降香、人參等質(zhì)地較硬的果實種子類、木類及粉質(zhì)角質(zhì)類藥材，先在表面涂抹些許清水，讓其向內(nèi)浸潤，數(shù)十秒之后，在已處理材料表面的浸潤與未浸潤之間切或削下薄片。

2.3 制片效果

草質(zhì)莖類藥材廣金錢草莖，切片制作顯微組織片（圖1B），非腺毛、薄壁細(xì)胞、韌皮部等不同的顯微鑒定特征清晰可見，符合顯微組織切片要求；莖木類藥材降香橫切面，降香導(dǎo)管、纖維清晰可見，木射線特征明顯，易于觀察（圖1C）；蔓荊子橫切面干材料，制作橫切面組織片（圖1D），外果皮、中果皮細(xì)胞清晰可見；角質(zhì)類藥材山羊角橫切面（圖1E），角質(zhì)細(xì)胞清晰。

2.4 對不同種類中藥材切片的觀察

西河柳莖的橫切（圖2A），可見為葉半包莖，橫切面典型特征為下陷的氣孔集中在一側(cè)，為葉所在的位置；草酸鈣簇晶集中分布于皮層的內(nèi)側(cè)，在中柱鞘附近形成連續(xù)的纖維束鞘，韌皮部較明顯，初生木質(zhì)部中間無髓，這些特征明顯的構(gòu)造鏡下清晰可見，較之《中國藥典》(2015 年版)收載的粉末鑒定圖相比，其精確性、準(zhǔn)確性均大大提高，且操作簡單。地錦草葉橫切面(圖2B）可見特有的C-4 花環(huán)式結(jié)構(gòu)。堿地蒲公英葉橫切面(圖2C）上表皮葉脈處向上凸起；表皮細(xì)胞壁向外加厚，側(cè)壁薄，內(nèi)側(cè)有1～2 層纖維束。益母草葉橫切（圖2D）可以見到小腺毛主要分布于上表皮，而大的腺鱗主要分布在下表皮。

生長年限較長的人參以傳統(tǒng)切片法難以得到完整的切片。用本法易于均勻用力，材料不易彎曲和滑動，可切到完整而厚薄均勻的切片 (圖2E)，顯微鏡下可清楚地觀察到其次生維管束有3 輪，形成層以外的樹脂道環(huán)有4 輪。由此可從兩個方面相互印證，確定此人參藥材的種植年限為4 年。雖然過去通過多張碎片也能得到同樣的結(jié)論，但有存在偏差的可能性。在實驗報告中提供這樣完整的照片作為佐證，其鑒定的效力可以明顯增加。

3 討論

中藥顯微鑒定是由西方植物解剖學(xué)沿用而來。西方植物組織解剖研究多用新鮮材料，中藥學(xué)家在使用這一技術(shù)時就自然想到先把藥材泡軟，使其重新恢復(fù)到新鮮植物的模樣。但這個“恢復(fù)”實則很難真正做到，在藥檢工作實踐中難以實現(xiàn)。故在顯微鑒定時也多選用其粉末顯微特征作為鑒定依據(jù)，盡管各種橫切面顯微特征通常都比單純的粉末在鑒定上更有價值。

在長期的中藥顯微檢驗工作實踐中，筆者逐漸摸索出了這種簡單、易操作、精確性及準(zhǔn)確性較高的顯微組織制片方法，相對于傳統(tǒng)的徒手懸空切片法，創(chuàng)新的切片法區(qū)別在于藥材下墊有硬木板或塑料板支撐，也可操作在載玻片上，使刀片立起從上往下切。故我們把這種方法稱之為“立式切片法”。由于干質(zhì)藥材在刀下不易變形，切出的部分往往更薄、更完整、更便于操作。我們探索出的這種切片制片方法的特點(diǎn)是：①安全，由指甲頂住刀片，避免傷到手指；②便于用力，拇指或中指下壓固定藥材，便于手指用力也便于控制切片厚度；③操作時材料下墊有硬板，在切片過程中極大程度地保持切片完整不粘連。④實驗過程中省去傳統(tǒng)徒手切片法材料預(yù)處理流程，可在很短的時間內(nèi)完成切片透化觀察的鑒定工作，提高了顯微鑒定工作的效率，且簡單易學(xué)。植物分泌組織切片過程中極易因處理過度而被破壞，但用立式切片法切不同質(zhì)地、不同藥用部位的干質(zhì)藥材均得到較好的結(jié)果，故分泌組織的特征得以顯現(xiàn)，如廣金錢草在韌皮中的黃色分泌物，在降香導(dǎo)管內(nèi)紅棕色分泌物和蔓荊子外果皮細(xì)胞的棕色顆粒狀物十分明顯（圖1B、C、D）；山羊角切片中的曲眉樣（圖1E）構(gòu)造特點(diǎn)也很突出，這些都為鑒定藥材提供了很好的證據(jù)。在實驗過程中，針對刀片易損、刀片變鈍后影響切片效果這一問題，筆者選用價格低廉的刀片，目前市面上各種美工刀與剃須刀非常鋒利、價格低廉，這種刀片刀口脆硬，容易崩損變鈍，但往往十分鋒利。在材料前處理后，僅用數(shù)刀即可完成切片工作，在刀片未鈍之前就拿到滿意的切片。文中筆者并未對立式快速徒手切片法的具體切片姿勢進(jìn)行細(xì)致的描述，因切藥是個人慣用姿勢的體現(xiàn)，在細(xì)微操作方面因人而異，只要經(jīng)過一段時間的練習(xí)，找到適合自己的立式徒手切片法即可。