白吉慶，王鵬飛，張姣姣，張 紅，王曉婷，張 晗,2，楊 琳,2，楊 蕾

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046； 2.陜西省中藥原料質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)服務(wù)中心，陜西 咸陽 712046；3.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710000)

小麥為禾本科植物小麥(TriticumaestivumL.)的干燥成熟果實[1]，浮小麥為其干燥輕浮癟瘦的果實[2]，其性涼，味甘咸，入心、脾、腎經(jīng)，具有止汗、除熱、益氣的功效，對自汗、盜汗、骨蒸勞熱等疾病有較好的療效[3-5]。葡萄糖是生命活動中不可缺少的物質(zhì)，在新陳代謝過程中起著重要的作用[6]。棉子糖是由半乳糖、果糖和葡萄糖結(jié)合而成，主治體虛多汗，可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)細菌平衡，顯著改善腸道菌群，保護肝臟，增加機體免疫力，抗腫瘤，促進鈣的吸收等[4,7-10]。2015年版《中國藥典》未對小麥、浮小麥的質(zhì)量控制做具體要求，僅在四部中記載了小麥、浮小麥的來源。本試驗通過柱前衍生化[11-16]，采用高效液相色譜建立小麥、浮小麥中葡萄糖和棉子糖的含量測定方法，為小麥、浮小麥的質(zhì)量控制和質(zhì)量評價奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

戴安 Ultimate 3000 全自動高效液相色譜儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司，包含 Ultimate 3000 四元梯度泵、Ultimate 3000 自動進樣器、Ultimate 3000 二極管陣列檢測器、Chromeleon 6.8色譜工作站)；Discovery DV215CD 型雙量程電子分析天平(瑞士賽多利斯集團，0.01 mg，0.1 mg)；Direct-Q 3UV 純化水機(默克密理博)；超聲清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；DFT-50A 手提式高速粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司制造)；HX-25 型電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海宜昌儀器紗篩廠)；德國Christ ALPHA 1-2LD plus 冷凍干燥機(上海甄明科學(xué)儀器有限公司)；TGL-16G 型臺式離心機；C18固相萃取柱(200 mg/3 mL，安捷倫科技有限公司)。

1.2 試劑與藥材

水為超純水(自制)；乙腈、甲醇(色譜純)購自美國迪馬公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(純度 ≥ 99.0%)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純；葡萄糖對照品(HPLC ≥ 98%，批號：BCY-000577)購自江西佰草源生物科技有限公司；棉子糖對照品(HPLC ≥ 98%，批號：BCY-01104)購自上海源葉生物科技有限公司；小麥、浮小麥藥材信息見表1。

表1 小麥、浮小麥樣品來源信息

1.3 試驗方法

1.3.1 提取工藝優(yōu)化

以葡糖糖、棉子糖含量為指標綜合評分，按L9(34)正交試驗表安排試驗，對試驗結(jié)果進行方差分析，考察乙醇濃度(A)、超聲時間(B)和提取次數(shù)(C)三個因素的最佳提取工藝。每個因素三個水平，見表2。

表2 葡萄糖、棉子糖提取工藝因素水平表

1.3.2 葡糖糖、棉子糖含量測定

1.3.2.1 色譜條件 Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為 0.01 mol/L pH 值為7的乙酸銨緩沖液：乙腈(V/V，80∶20)；體積流量1 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫30℃；進樣量5 μL。

1.3.2.2 PMP溶液的制備 精密稱取435 mg PMP，置5 mL的量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得；氫氧化鈉溶液的制備：精密稱取60 mg氫氧化鈉，置5 mL的量瓶中，加水溶解至刻度，即得。

1.3.2.3 對照品衍生溶液的制備 精密稱定葡萄糖對照品 5.85 mg，棉子糖對照品 6.61 mg，加PMP溶液和氫氧化鈉溶液各1 mL，置70℃水浴鍋中反應(yīng)1.5 h，用鹽酸調(diào)pH約7，加入1 mL二氯甲烷混勻，離心(13 000 r/min，5 min)，取上清液，用冰醋酸調(diào)pH 4～5，加入1 mL二氯甲烷混勻，至二氯甲烷萃取層近無色，取上清液于60℃水浴揮干，用1 mL水溶解，過C18小柱，先用3 mL水洗脫，棄去洗脫液，再用3 mL 25%乙腈洗脫，收集洗脫液，60℃水浴揮干，殘渣精密加入1 mL水充分溶解，過 0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為對照品衍生化溶液的儲備液。取上述儲備液適量加水稀釋成一系列濃度梯度的對照品衍生化溶液(葡萄糖衍生物質(zhì)量濃度分別為0.139 5、0.279、0.697 5、1.395、2.79 mg/mL，棉子糖衍生物質(zhì)量濃度分別為0.165 25、0.826 25、3.305、9.915、16.525、26.44 mg/mL)。

1.3.2.4 供試品衍生溶液的制備 取小麥、浮小麥粉末各3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理(80 W，45 kHz)30 min，放冷，再次稱定重量，用60%乙醇補足減失的重量，過濾，濾液于80℃水浴蒸干，殘渣加水溶解，冷凍干燥。取凍干后樣品6 mg，精密稱定，按“1.3.2.3”項下的方法“自加PMP溶液和氫氧化鈉溶液各1 mL起”，進行衍生化處理，即得供試品衍生化溶液。

1.3.2.5 線性關(guān)系 精密吸取“1.3.2.3”項下的溶液各1 μL注入液相色譜儀，測定，以峰面積為縱坐標 (Y)，質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標 (X)，進行線性回歸。

1.3.2.6 精密度試驗 精密吸取“1.3.2.4”項下的同一供試品溶液1 μL，連續(xù)進樣6次， 按“1.3.2.1”項下色譜條件進行測定。

1.3.2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批號供試品6份, 按“1.3.2.4”項下方法制備供試品衍生化溶液, 按“1.3.2.1”項下色譜條件進行測定。

1.3.2.8 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“1.3.2.4”項下的同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、16 h精密吸取1 μL，按“1.3.2.1”項下色譜條件測定。

1.3.2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的浮小麥、小麥粉末各6份，分別精密加入一定量的葡萄糖、棉子糖對照品，按“1.3.2.4”項下方法制備供試品衍生化溶液，按“1.3.2.1”項色譜條件下進樣測定。

1.3.2.10 樣品的含量測定 精密吸取“1.3.2.4”項下的供試品衍生化溶液各5 μL，按“1.3.2.1”項色譜條件下進樣測定。

2 結(jié)果

2.1 葡萄糖、棉子糖提取工藝優(yōu)化

由表4、5可見，影響葡萄糖、棉子糖提取的因素主次順序為乙醇濃度>超聲時間>提取次數(shù)，其中乙醇濃度對葡萄糖、棉子糖提取的影響有統(tǒng)計學(xué)意義；超聲時間和提取次數(shù)對提取工藝無統(tǒng)計學(xué)意義，但由表3可知，提取30 min比提取15 min和45 min的含量高，提取次數(shù)對含量影響不大。綜合考慮，既要葡萄糖、棉子糖提取含量最高，又要節(jié)約成本，所以確定最佳提取工藝為A2B2C1，即用60%乙醇超聲30 min提取1次。

表3 優(yōu)化葡萄糖、棉子糖提取工藝的正交試驗結(jié)果

表4 葡萄糖含量方差分析結(jié)果

表5 棉子糖含量方差分析結(jié)果

2.2 色譜條件的優(yōu)化

采用二極管陣列檢測器對含量測定的檢測波長進行了選擇。結(jié)果表明，檢測波長在254 nm處，所得各色譜峰譜圖信息量較大，且色譜峰分離度較好，所以選用254 nm。對流動相的比例進行了優(yōu)化，最終選用“1.3.2.1”項下的色譜條件進行等度洗脫。

2.3 葡萄糖、棉子糖含量測定

所得回歸方程為：y葡萄糖=4.416 7x-0.086 2，R2=0.999 5，葡萄糖在0.139 5～2.79 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；y棉子糖=6.613 5x-0.690 3，R2=0.999 9，棉子糖在0.165～26.44 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。精密度試驗中葡萄糖、棉子糖峰面積的RSD值分別為2.74%、1.46%，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗中葡萄糖、棉子糖峰面積的RSD值分別為2.31%、2.09%，表明16 h內(nèi)供試品的穩(wěn)定性良好；重復(fù)性試驗中葡萄糖、棉子糖峰面積的RSD值分別為1.51%、1.76%，表明該方法的重復(fù)性良好；葡萄糖、棉子糖的平均回收率分別為98.7%(RSD=2.42%)、99.1%(RSD=2.81%)，表明該方法的回收率良好(表6)。小麥和浮小麥中葡萄糖、棉子糖含量見表7，對照品和供試品色譜圖見圖1。

表6 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

表7 小麥、浮小麥中葡萄糖與棉子糖的含量

圖1 對照品與供試品HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of chemical reference substances and sample.注：A-棉子糖對照品；B-葡萄糖對照品；C-小麥供試品；D-浮小麥供試品

3 討論

本試驗分別考察了提取溶劑(30%乙醇、60%乙醇、 90%乙醇)，超聲時間(15、30、60 min)和提取次數(shù)，結(jié)果60%乙醇超聲30 min 提取1次的樣品溶液的峰形好，峰面積較大，而且分離度較好。考察了反應(yīng)的水浴溫度和時間，表明在70℃水浴鍋中反應(yīng)1.5 h，反應(yīng)完全，故反應(yīng)溫度和時間確定為70℃水浴中反應(yīng)1.5 h。

本試驗分別考察了流動相乙腈-0.01 mol/L乙酸銨緩沖液、乙腈-0.03 mol/L乙酸銨緩沖液、乙腈-0.05 mol/L乙酸銨緩沖液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.01 mol/L乙酸銨緩沖液為流動相，各色譜峰分離效果最好?？疾炝藱z測波長245、254、265 nm，柱溫25、30、35℃，結(jié)果表明在254 nm和30℃下，色譜峰峰形好，吸收強度高。

含量測定結(jié)果表明：小麥中葡萄糖含量最高的是鳳翔縣崖彎村11.75 mg/mL，最低是鳳翔縣關(guān)家村6.19 mg/mL，棉子糖含量最高的是鳳翔縣白家凹村101.79 mg/mL，最低是鳳翔縣關(guān)家村55.28 mg/mL；浮小麥中葡萄糖含量最高的是鳳翔縣貸箭門前12.95 mg/mL，最低是鳳翔縣宋家村7.19 mg/mL，棉子糖含量最高的是鳳翔縣白家凹村137.05 mg/mL，最低是鳳翔縣關(guān)家村95.98 mg/mL。造成鳳翔縣各地葡萄糖和棉子糖含量差異的原因有待進一步研究。小麥和浮小麥中棉子糖含量遠遠大于葡萄糖含量。

本試驗建立了不同產(chǎn)地小麥、浮小麥中葡萄糖和棉子糖的柱前衍生HPLC含量測定方法。方法學(xué)結(jié)果表明其精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，可為小麥、浮小麥質(zhì)量標準的制定提供試驗依據(jù)。