杜海林，張文勇，楊紹兵，賈紹斌

血清同型半胱氨酸（Hcy）是人體經(jīng)食物攝入的一種含硫氨基酸，異常升高的Hcy可通過(guò)多種不同機(jī)制誘導(dǎo)疾病的發(fā)生[1]。在Hcy誘導(dǎo)疾病發(fā)生的機(jī)制中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是近年來(lái)備受關(guān)注的研究熱點(diǎn)[2]。生理?xiàng)l件下，ERS相關(guān)蛋白胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）處于失活狀態(tài)。病理狀態(tài)下，PERK與未正確折疊的蛋白結(jié)合，觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[3]。如損傷因素誘發(fā)的ERS持續(xù)存在，PERK磷酸化為磷酸化PERK（p-PERK）,激活CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）以及其下游靶點(diǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶α（ERO1α），而活化后的CHOP和ERO1α被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因子[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[5]，除動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致缺血外，Hcy亦是導(dǎo)致慢性心力衰竭的又一獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6]。目前Hcy通過(guò)ERS導(dǎo)致動(dòng)脈斑塊形成的研究較多，而Hcy對(duì)心肌直接影響尚鮮見(jiàn)報(bào)道。為研究Hcy是否直接介導(dǎo)了心肌損傷，本課題組設(shè)計(jì)了此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，旨在探討血清Hcy對(duì)心肌的損傷作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2016年11月10日至2018年1月16日。實(shí)驗(yàn)小鼠（SPF級(jí)）由北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，并通過(guò)寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；動(dòng)物生長(zhǎng)維持飼料及高蛋氨酸（HM）飼料購(gòu)自北京科奧協(xié)力飼料有限公司；ERS阻斷劑4-苯基丁酸(4-PBA)，購(gòu)自Sigma公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)；鼠抗β-actin單抗購(gòu)自中杉金橋；ER-Stress抗體試劑盒購(gòu)自CST公司；Hcy測(cè)定試劑盒購(gòu)自山東博邁達(dá)生物科技有限公司；全蛋白提取試劑盒及BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自凱基生物。

1.2 動(dòng)物模型的建立

健康5周齡ApoE基因敲除實(shí)驗(yàn)小鼠27只，均于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境下飼養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照組、HM組及4-PBA組，每組各9只。對(duì)照組給予小鼠生長(zhǎng)維持飼料喂養(yǎng)，HM組及4-PBA組給予HM飼料喂養(yǎng)。Hcy是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，給予高蛋氨酸飲料喂養(yǎng)用于構(gòu)建小鼠高Hcy血癥模型。所有實(shí)驗(yàn)小鼠喂養(yǎng)16周后，4-PBA組給予腹腔內(nèi)注射ERS阻斷劑4-PBA[7]，劑量為5 mg/kg,每周兩次，共12周，其余兩組小鼠均按原飼養(yǎng)方法繼續(xù)喂養(yǎng)12周。所有小鼠共完成28周干預(yù)后處死，快速眼球取血用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，心臟經(jīng)多聚甲醛灌注后剝離，留取標(biāo)本分別固定及凍存，其中固定標(biāo)本浸泡于4%多聚甲醛，凍存標(biāo)本經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱。

1.3 血清Hcy測(cè)定

所有小鼠全血經(jīng)4 000 g離心10 min后取上層血清，使用Hcy測(cè)定試劑盒檢測(cè)血清Hcy濃度，首先用試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線R2=0.997，再將每個(gè)樣本檢測(cè)三次，取三次結(jié)果的平均值作為該小鼠血清Hcy濃度，分組記錄。

1.4 電鏡觀察心肌細(xì)胞器

剝離小鼠心臟后采集心肌組織，在4℃環(huán)境下行前固定、后固定、脫水、分組包埋，分別取心肌細(xì)胞橫軸及縱軸切片，電鏡下3 000倍觀察細(xì)胞器。

1.5 心肌組織蘇木素-伊紅（HE）染色及免疫組化

所有固定心肌組織經(jīng)脫水后行石蠟包埋及切片，常規(guī)脫蠟、脫水，HE染色觀察各組小鼠心肌大體結(jié)構(gòu)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)。免疫組化切片繼續(xù)行高壓修復(fù)，山羊血清封閉，加ERO1α單克隆抗體于4℃冰箱過(guò)夜，次日按辣根過(guò)氧化物本酶（DAB）顯色試劑盒操作，并行HE染色，封片，正置顯微鏡下觀察染色效果，采集圖像。

1.6 心肌組織蛋白免疫印跡（Western blot）

稱取凍存心肌組織50 mg，使用全蛋白提取試劑盒，按試劑盒操作說(shuō)明完成蛋白提取，BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白含量，取60 μg蛋白樣品，以10%SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，室溫下脫脂牛奶封閉 90 min，加入一 抗PERK(兔 源1 :1 000)、CHOP(鼠源1 :1 000)、ERO1α(兔源1 :1 000)、β-actin(鼠源1 :2 000)于4℃孵育過(guò)夜，次日洗膜后加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育 1 h，ClinxChemiScope6300自動(dòng)曝光，并使用設(shè)備配套軟件分析條帶灰度值，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)包分析。連續(xù)變量采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組之間比較使用方差分析；所有統(tǒng)計(jì)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，當(dāng)P≤0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清Hcy測(cè)定評(píng)估模型建立

與對(duì)照組比較，HM組及4-PBA組血清Hcy水平增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；與HM組比較，4-PBA組血清Hcy水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），如圖1所示。

圖1 三組小鼠血清Hcy水平比較(n=9)

2.2 心肌組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞器的形態(tài)學(xué)觀察

通過(guò)光鏡觀察HE染色的心肌切片，分別在100倍及200倍鏡下觀察。三組心肌細(xì)胞HE染色良好，心壁無(wú)明顯增厚及變薄，心肌細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)均勻，無(wú)病理性核分裂相，光鏡下各組心肌組織未見(jiàn)明顯差異（圖2A）。電鏡下觀察所見(jiàn)，胞核細(xì)胞器形態(tài)正常，HM組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，結(jié)構(gòu)紊亂，在多個(gè)切面可見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)張，4-PBA組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹及擴(kuò)張明顯減輕，偶有視野可見(jiàn)上述改變（圖2B）。

2.3 ERO1α的免疫組化結(jié)果

光鏡下觀察免疫組化效果，由于ERO1α表達(dá)于胞漿，先于低倍鏡下觀察大體表達(dá)差異，再計(jì)數(shù)高倍鏡下每視野胞漿著色細(xì)胞與該視野細(xì)胞總數(shù)之比，作為ERO1α表達(dá)的定量指標(biāo)。每組計(jì)數(shù)五個(gè)視野，分別計(jì)算每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，將五個(gè)視野的平均百分?jǐn)?shù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,如圖3所示，與對(duì)照組比較，HM組及4-PBA組胞漿中ERO1α表達(dá)增加,差異均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）；與HM組比較，4-PBA組胞漿ERO1α表達(dá)減少，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 蘇木素-伊紅染色光鏡觀察心肌組織結(jié)構(gòu)及電鏡下觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)

圖3 免疫組化法顯示ERO1α在不同組間表達(dá)

2.4 Western blot檢測(cè)PERK、CHOP、ERO1α在心肌組織中表達(dá)（圖4）

PERK、CHOP、ERO1α等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白在對(duì)照組心肌細(xì)胞有少量表達(dá)，與對(duì)照組比較，HM組PERK、CHOP、ERO1α表達(dá)均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01)；與對(duì)照組比較，4-PBA組PERK、ERO1α表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01)，CHOP表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與HM組比較，4-PBA組PERK、CHOP、ERO1α表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

圖4 蛋白免疫印跡法顯示PERK、CHOP、ERO1α在各組中表達(dá)

3 討論

人體經(jīng)食物攝入的蛋氨酸經(jīng)過(guò)代謝產(chǎn)生具有毒性作用的中間產(chǎn)物--Hcy，目前各領(lǐng)域相關(guān)研究證實(shí)其毒性作用表現(xiàn)為致全身多系統(tǒng)疾病，包括2型糖尿病、惡性腫瘤、腎臟疾病及動(dòng)脈粥樣硬化等[8-9]，本課題組研究第一次從病理角度觀察到Hcy對(duì)心肌的直接損傷，在心肌大體組織結(jié)構(gòu)并無(wú)明顯改變時(shí)，Hcy已通過(guò)超微結(jié)構(gòu)變化，影響心肌細(xì)胞功能。

心血管疾病與腫瘤是近年WHO公布的主要疾病譜，心血管疾病危險(xiǎn)因素包括吸煙、高血壓、高脂血癥、糖尿病等，近年將缺乏運(yùn)動(dòng)及血清高Hcy（≥10 μml/L）列為心血管疾病的危險(xiǎn)因素[10]。關(guān)于Hcy與心血管疾病相關(guān)性，目前較為明確的有：（1）Hcy通過(guò)影響烷類物質(zhì)及嘌呤的代謝，導(dǎo)致超氧化陰粒子堆積，誘發(fā)氧化應(yīng)激[11]；（2）高血清Hcy導(dǎo)致氧化低密度脂蛋（ox-LDL）異常表達(dá)[12]，誘導(dǎo)血管中層平滑肌細(xì)胞增殖加速動(dòng)脈粥樣硬化（AS）[13]；（3）誘導(dǎo)生長(zhǎng)抑制因子和DNA損傷誘導(dǎo)因子（GADD34）以及T細(xì)胞死亡基因51（TDAG51）表達(dá)，誘發(fā)ERS[14]。本課題組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予小鼠28周高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)，血清Hcy水平增高，由于4-PBA作用于Hcy所致ERS的下游[15]，并未導(dǎo)致HM組與PBA組小鼠Hcy水平的差異，成功構(gòu)建高Hcy模型。與對(duì)照組比較，HM組心肌細(xì)胞ERS相關(guān)因子PERK、CHOP、ERO1α表達(dá)均有增高，盡管光鏡下組織大體形態(tài)結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯變化，但細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)已存在改變，給予4-PBA阻斷ERS后以上因子表達(dá)下降、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹亦有所改善,提示血清Hcy水平增高觸發(fā)ERS，而阻斷ERS通路后，CHOP、ERO1α等因子表達(dá)下降，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化亦有所改善。細(xì)胞中表達(dá)增高的CHOP及ERO1α的被認(rèn)為是病理性ERS的觸發(fā)因子[14]，由此證實(shí)長(zhǎng)時(shí)間血清高Hcy水平損傷心肌細(xì)胞，其機(jī)制可能為高Hcy激活ERS所致，當(dāng)過(guò)度的損傷超過(guò)了UPR的代償能力，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定將無(wú)法維持，此時(shí)ERS會(huì)激活線粒體凋亡通路，誘導(dǎo)損傷細(xì)胞凋亡[16]，心肌細(xì)胞凋亡后會(huì)繼續(xù)發(fā)生心肌重構(gòu)，最終導(dǎo)致慢性心力衰竭的發(fā)生[5]。

目前對(duì)高Hcy的防治主要策略是在食物或藥物中加用葉酸及維生素B12加速其代謝[17]，這類治療策略的顯著特點(diǎn)是以降低血清Hcy水平為目的。近來(lái)一些臨床相關(guān)的Meta分析顯示，補(bǔ)充葉酸治療可以降低腦血管事件，但并不能降低心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)[18]。因此需要探索新的手段對(duì)臨床高Hcy進(jìn)行干預(yù)。4-PBA作為一種小分子脂肪酸，起初應(yīng)用于鐮狀細(xì)胞貧血和地中海貧血的臨床治療，近年研究證實(shí)其為一種分子伴侶，可逆轉(zhuǎn)未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白而減輕ERS，在本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)同樣為血清高濃度Hcy的4-PBA組小鼠給予4-PBA干預(yù)，目的是通過(guò)阻斷ERS通路后，檢測(cè)ERS相關(guān)因子的表達(dá)，結(jié)果顯示其ERS相關(guān)因子CHOP、ERO1α表達(dá)確有下降，電鏡下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)也確有改善，再次證實(shí)高Hcy血癥觸發(fā)了ERS而介導(dǎo)的心肌損傷。其機(jī)制可能是4-PBA作為分子伴侶，協(xié)助信號(hào)分子指導(dǎo)蛋白折疊，減輕ERS負(fù)擔(dān)，從而抑制 CHOP以及其下激分子ERO1-α轉(zhuǎn)錄和翻譯，減輕心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[19]。4-PBA干預(yù)后出現(xiàn)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及分子水平的改變進(jìn)一步佐證Hcy通過(guò)ERS介導(dǎo)心肌損傷，并提示阻斷ERS可能為干預(yù)Hcy所致心臟病的一個(gè)新靶點(diǎn)[20]。

此外我們的研究仍然存在不足之處，如未設(shè)計(jì)正常飼料喂養(yǎng)組并經(jīng)4-PBA組，無(wú)法說(shuō)明4-PBA對(duì)心肌單獨(dú)效應(yīng)；未進(jìn)一步探討CHOP及ERO1α經(jīng)過(guò)何種改變導(dǎo)致表達(dá)增加，如是否和基因的乙?；图谆^(guò)程相關(guān)等，以上不足。我們將會(huì)在后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中加以完善。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突