孫同清

（青島啤酒（三水）有限公司，廣東佛山 528100）

酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） 是自然界分布甚廣的一類真菌，為發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)的重要微生物，由于其具有生長迅速易培養(yǎng)的特點，在科學研究和生產(chǎn)實踐中有著廣泛的應用。

海藻糖是一種非還原性二糖，廣泛存在于海藻、酵母、霉菌和食用菌等生物體內(nèi)，是一種貯藏性碳水化合物。海藻糖具有保護細胞核等物質，在脫水、干燥、高溫、冷凍及高滲透壓等不良環(huán)境條件下活性免遭破壞的功能，是國際上最近開發(fā)的主要低聚糖之一。海藻糖在微生物細胞中的合成非常強烈。它的積累一般和生長速度的降低有關，特別是在分化過程和營養(yǎng)不足時，可由酶直接催化合成海藻糖。

若將酵母細胞置于饑餓條件下，其產(chǎn)海藻糖的量也會大大提高，當海藻糖含量越高時，酵母細胞對干燥的抵抗力也明顯增強。在酵母的整個生命周期，海藻糖在再生階段積累，在出芽期間流動，生長速度降低促進海藻糖的積累。

本文以高抗性產(chǎn)海藻糖釀酒酵母菌株ZGJ-4 為研究對象，從菌學特征、抗性研究、酵母菌ZGJ-4發(fā)酵制備海藻糖的工藝研究等三方面對ZGJ-4 的開發(fā)進行了探討，全面分析ZGJ-4 的應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗試劑

葡萄糖，分析純，天津市凱通化學試劑有限公司；瓊脂，生化試劑，天津市科密歐化學試劑有限公司；乙醇，分析純，天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠；磷酸二氫鉀，分析純，天津市天力化學試劑有限公司；磷酸氫二鉀，分析純，天津市天力化學試劑有限公司；氯化鉀，分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司；海藻糖，色譜純級標準品，SIGMA 公司。

1.1.2 試驗儀器

SYQ-DSX-280B，手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海申安；AR1140，電子精密天平，上海奧豪斯；THZ-C，恒溫振蕩器，江蘇太倉；SW-CJ-2D，雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化；PYX-190S-A，恒溫培養(yǎng)箱，廣東科力；UPT-I-10L，優(yōu)譜UPT 系列超純水器，上海優(yōu)譜；DNP-916BS-III，電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗；LC-2010HT，高效液相分析儀，日本島津SHIMADZU。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

斜面培養(yǎng)基與平板培養(yǎng)基（g/L）：豆芽汁100 mL（豆芽除頭除尾加熱30 min，用4～6 層紗布過濾），加10 g 葡萄糖，4 g 瓊脂制成培養(yǎng)基，在0.1 MPa、121 ℃條件下滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基（g/L）：豆芽汁100 mL（豆芽除頭除尾加熱30 min，用4～6 層紗布過濾），加10 g 葡萄糖制成液體培養(yǎng)基，在0.1 MPa、121 ℃條件下滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏45 g，蛋白胨15 g，（NH4）2SO415 g，葡萄糖60 g，制成3 L 發(fā)酵培養(yǎng)基，在0.1 MPa，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2.2 產(chǎn)海藻糖酵母菌ZGJ-4 的菌學特性

將野生皺皮柑剝皮，榨汁，裝入瓶中。將自行發(fā)酵帶果香的皺皮柑汁液，吸取0.2 mL均勻涂布于裝有已滅菌斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，28 ℃恒溫箱培養(yǎng)2 d 后，觀察菌落特征，其菌落生長良好，具有明顯酵母菌菌落特征，經(jīng)進一步純化培養(yǎng)，選擇果香不太明顯、菌落形成較小、乳白色的菌體，在無菌操作臺上劃線進一步接種于新鮮斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為36 ℃，培養(yǎng)3 d。待長出菌落后進一步采用分區(qū)劃線法進行純化，重復以上步驟3～5 次，直至分離出純單菌株。采用鏡檢和基因測序技術對菌學特征進行描述。

1.2.3 產(chǎn)海藻糖酵母菌ZGJ-4 的抗性研究

1.2.3.1 酵母菌ZGJ-4 的抗酒精測試

采用平板培養(yǎng)基配方，在40 ℃時分別于培養(yǎng)基中加入2.0 mL、2.4 mL、2.8 mL、3.2 mL、3.6 mL、4.0 mL 無水乙醇，pH 自然，倒平板凝固，涂布0.2 mL 菌液，于28 ℃恒溫培養(yǎng)7d，考察不同添加量的無水乙醇對酵母菌菌落生長狀況的影響。

1.2.3.2 酵母菌ZGJ-4 的抗?jié)B透壓測試

采用液體培養(yǎng)基配方，加入不同量的KCL 使其在培養(yǎng)基中的濃度分別為1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L、3.0 mol/L，pH 自然，裝液量50 mL/250 mL 錐形瓶，接種量為2%，于28 ℃，160 r/min，培養(yǎng)5 d，考察不同滲透壓下酵母菌菌落生長狀況。

1.2.3.3 酵母菌ZGJ-4 的抗饑餓時間測試

采用液體培養(yǎng)基配方，裝液量50 mL/250 mL錐形瓶，接種量為2%，接種菌株均經(jīng)過不同天數(shù)的饑餓處理，在室溫25 ℃條件下饑餓天數(shù)為3 d、5 d、7 d、9 d 和11 d，再置于28 ℃，160 r/min，培養(yǎng)5 d，考察不同饑餓程度對酵母菌菌落生長狀況的影響。

1.2.3.4 酵母菌ZGJ-4 的抗高溫測試

采用斜面培養(yǎng)基，pH 自然，倒平板凝固，涂布0.2 mL 菌液，分別于20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃和40 ℃溫度下恒溫培養(yǎng)7 d，考察高溫對酵母菌菌落生長狀況的影響。

1.2.3.5 酵母菌ZGJ-4 的抗高糖測試

采用液體培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)基中分別按比例5%、10%、15%、20%、25%、30%添加蔗糖，pH自然，裝液量50 mL/250 mL 錐形瓶，接種量為2%。在28 ℃、160 r/min 條件下培養(yǎng)5 d，考察不同含糖量對酵母菌菌落生長狀況的影響。

1.2.3.6 酵母菌ZGJ-4 的抗低pH 測試

采用液體培養(yǎng)基配方，加入磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH，使pH 分別為3.0、4.0、5.0、6.0 和7.0，裝液量50 mL/250 mL 錐形瓶，接種量為2%，在28 ℃，160 r/min 條件下培養(yǎng)5 d，考察不同pH 對酵母菌菌落生長狀況的影響。

1.2.4 酵母菌ZGJ-4 制備海藻糖工藝研究

1.2.4.1 工藝流程

斜面菌種→菌種擴培→發(fā)酵培養(yǎng)→收集菌體→饑餓處理→干燥脫水→干燥粉碎→膜過濾→濃縮結晶

1.2.4.2 操作過程

a） 接種。將含有酵母菌ZGJ-4 的斜面菌苔，刮取2 環(huán)菌體接種到內(nèi)裝10 mL 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，溫度32 ℃、220 r/min 條件下培養(yǎng)2 d。

b） 菌種擴培。將培養(yǎng)基中長勢良好的酵母菌ZGJ-4 菌液，接種到盛有100 mL 種子培養(yǎng)基的1 L搖瓶中，發(fā)酵溫度32 ℃，220 r/min 條件下培養(yǎng)2 d。

c） 發(fā)酵培養(yǎng)。將擴培好的酵母菌ZGJ-4 菌液，按8%的比例接種到盛有3 L 發(fā)酵培養(yǎng)基的10 L 發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵4 d。

d） 收集菌體，讓菌體饑餓處理3 h，再用離心機脫水并烘干，用粉碎機粉碎。

e） 用去離子水溶解，均勻攪拌1 h，再用超濾膜過濾。

f） 濃縮結晶:將濾液在一定條件下濃縮，得海藻糖產(chǎn)品。

g） 檢測：經(jīng)HPLC 檢測，檢測方法參照文獻[9]、[10]。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)海藻糖酵母菌ZGJ-4 的菌學特性

經(jīng)培養(yǎng)，菌株在高溫條件下，斜面培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色（圖1），酵母菌長勢良好。挑取酵母菌單菌體做裝片，在顯微鏡下觀察酵母菌的個體形態(tài)（圖2）。

形態(tài)特征：在斜面培養(yǎng)基上，菌落大小為6 mm～8 mm，正面圓形，側面為低凸面，邊緣整齊，乳白色，濕潤，較光滑，黏稠，易用接種環(huán)挑取，有微弱的果香味、酸味產(chǎn)生。在液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)時，有菌環(huán)，沉淀，菌液混濁，產(chǎn)氣明顯。在普通光學顯微鏡下觀察，細胞個體呈球形或橢圓形，直徑約為（5.2～12.7） μm。單個或成雙，芽殖。

圖1 斜面菌苔

圖2 個體形態(tài)

生理生化特征：ZGJ-4 與GenBank 上其他酵母菌的18S rRNA 和26S rRNA 核苷酸序列的一致性分別為99%和97%，該菌株屬于釀酒酵母。在碳源的氧化測定中，當以D-海藻糖為唯一碳源時，GZJ-4 具有強氧化能力，測定結果呈陽性，菌株生長能力好，代謝產(chǎn)物積累顯著；當以蔗糖、α-D-葡萄糖、麥芽糖、D-棉子糖、龍膽二糖等為唯一碳源時，GZJ-4 氧化能力呈弱陽性，菌株生長能力較弱，代謝產(chǎn)物積累不顯著。在碳源利用上，ZGJ-4 可以有效利用D-海藻糖，其次利用龍膽二糖、麥芽糖、蔗糖、α-D-葡萄糖，不能利用D-蜜二糖、纖維二糖、D-半乳糖和糊精等。

2.2 產(chǎn)海藻糖酵母菌ZGJ-4 的抗性研究

2.2.1 酵母菌ZGJ-4 的抗酒精測試結果

酵母菌ZGJ-4 的抗酒精測試結果見表1。

表1 酵母菌ZGJ-4 的抗酒精測試結果

由表1 可知，當酒精添加量逐漸增加時，酵母菌的生長與繁殖受到的抑制程度就越強烈，其菌落表現(xiàn)出的性狀就越不正常。當酒精添加量超出2.8 mL，酵母菌生長開始受到限制，酒精含量越高菌種越易出現(xiàn)自溶退化的現(xiàn)象。

2.2.2 酵母菌ZGJ-4 的抗?jié)B透壓測試結果

酵母菌ZGJ-4 的抗?jié)B透壓測試結果見表2。

表2 酵母菌ZGJ-4 的抗?jié)B透壓測試結果

由表2 可知，酵母菌的生長受培養(yǎng)液滲透壓的影響較大；當培養(yǎng)液中的KCl 濃度超過2.0 mol/L時，此時培養(yǎng)液的滲透壓已經(jīng)超出了酵母菌所能承受的極限，在此環(huán)境下酵母菌無法進行正常生長與繁殖，所以培養(yǎng)液中酵母菌體含量很低，培養(yǎng)液呈現(xiàn)清亮透明狀。

2.2.3 酵母菌ZGJ-4 的抗饑餓測試結果

酵母菌ZGJ-4 的抗饑餓測試結果見表3。

表3 酵母菌ZGJ-4 的抗饑餓測試結果

由表3 可知，饑餓7 d 內(nèi)對酵母菌的正常生長、繁殖影響不大。當酵母菌由饑餓環(huán)境轉移到培養(yǎng)基中時很快就可以進行正常的生長繁殖。由此可知，當酵母菌饑餓時有可能進入了休眠狀態(tài)，以芽孢的形態(tài)幫助度過饑餓時間，當酵母菌被接種到新鮮的培養(yǎng)基中時很快就從休眠狀態(tài)蘇醒進行正常的生長繁殖。

2.2.4 酵母菌ZGJ-4 的抗高溫測試結果

普通酵母菌的最適生長溫度為26 ℃～28 ℃，耐受溫度為38 ℃，高溫會大大抑制酵母菌的生長，一般情況下當溫度達到一定程度時酵母菌的生長會受到強烈抑制甚至停止生長，就算有所生長所表達出來的性狀也很糟糕，這個溫度即酵母菌的耐受極限溫度。

酵母菌ZGJ-4 的抗高溫測試結果見表4。

表4 酵母菌ZGJ-4 的抗高溫測試結果

由表4 可知，酵母菌ZGJ-4 在28 ℃～32 ℃下生長良好，且在40 ℃高溫條件下，該菌仍能生長，其形態(tài)結構、生理特征等未發(fā)生變化，研究表明酵母菌ZGJ-4 具有一定的抗高溫能力。

2.2.5 酵母菌ZGJ-4 的抗高糖測試結果

酵母菌ZGJ-4 的抗高糖測試結果見表5。

表5 酵母菌ZGJ-4 的抗高糖測試結果

由表5 可知，培養(yǎng)基中含糖量對酵母菌的生長繁殖無明顯影響，可能是因為在接種后一段時間內(nèi)酵母菌進行生長繁殖消耗了大量糖分，而維持菌體生長繁殖代謝則需要不斷補充蔗糖等碳源物質的供給。

2.2.6 酵母菌ZGJ-4 的抗低pH 測試結果

酵母菌ZGJ-4 的抗低pH 測試結果見表6。

表6 酵母菌ZGJ-4 的抗低pH 測試結果

由表6 可知，酵母菌在pH 為3.0～7.0 這個范圍內(nèi)，具有較好的生長狀況，但是在pH 為3.0～5.0時，酵母菌具有較強的生長和繁殖能力，所以對應的培養(yǎng)液內(nèi)其渾濁程度最高，在這幾組試驗中，當pH 為4.0 時，酵母菌的代謝是最活躍的，所以此條件下產(chǎn)生的發(fā)酵液具有濃郁酒香味。

2.3 酵母菌ZGJ-4 發(fā)酵制備海藻糖的試驗結果

8%酵母懸液→過80 目篩2 次→加5%酒石酸，沉降30 min→4 ℃，3 600 r/min 離心10 min→棄去上清液→HPLC 檢測。檢測結果為：每100 g 干重細胞含有35 g 海藻糖，海藻糖得率＞80%。

3 結論

綜上所述，酵母菌ZGJ-4 在高溫、高糖、低pH 和饑餓等條件下均能正常生長，未發(fā)生菌株形態(tài)變異、菌株性能退化等現(xiàn)象，說明酵母菌ZGJ-4具備抗高溫、抗饑餓等顯著性特征，所以酵母菌ZGJ-4 可用來制備海藻糖。同時，由于ZGJ-4 來自汁液偏酸（pH4.5） 的皺皮柑，對高酸性環(huán)境有很強忍耐力，因此還可應用于果汁尤其是高酸性果汁如山葡萄汁、獼猴桃汁和山楂汁等的發(fā)酵，酵母菌ZGJ-4 有很大的開發(fā)前景。