郭小雷

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院急癥部，天津 300381）

糖尿病腎?。―KD）是終末期腎病最常見的病因，臨床主要表現(xiàn)為尿蛋白漸進性增多及腎功能的逐步減退[1]。足細胞是腎小球臟層上皮細胞，對維持腎小球的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、濾過屏障的正常功能有重要作用。足細胞損傷會影響腎小球濾過功能，導(dǎo)致蛋白尿出現(xiàn)[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸蛋白激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（JAK-STAT）途徑與DKD進行性發(fā)展密切相關(guān)。在早期和進展性DKD的腎臟多種細胞中（包括腎小球足細胞）均發(fā)現(xiàn)JAK-STAT基因表達增加[3]。在糖尿病小鼠的足細胞中選擇性過表達JAK2 mRNA，最終導(dǎo)致小鼠腎功能惡化，尿蛋白增多；而給予特異性JAK1/2抑制劑后，小鼠尿蛋白排泄改善，且與DKD進展有關(guān)的多種下游基因如STAT3等正常表達[4]。

目前，特異性JAK1/2抑制劑還仍處實驗階段，現(xiàn)有西醫(yī)治療DKD的方法近20年未有明顯變化[5]。中醫(yī)藥是中國傳統(tǒng)瑰寶，黃連是清熱藥，在治療消渴的方劑中多有使用，魏晉時的《名醫(yī)別錄》就有“黃連止消渴”的記載[6]。黃連素是由中藥黃連等中提取出的生物堿，循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，黃連素通過降低血糖、膽固醇、C-反應(yīng)蛋白的作用，不但降低血液黏稠度，從血流動力學(xué)方面改善腎小球的濾過能力，還可以減少對血管包括微血管的損害，治療DKD，降低尿蛋白[7]。黃連素也能改善足細胞的結(jié)構(gòu)和功能、抑制足細胞凋亡，其機制目前集中于抑制TLR4/NF-κB[8]、PI3K-Akt[9]通路活性，增強腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）活性[10]等方面。但黃連素改善足細胞功能的作用是否與JAK-STAT途徑相關(guān)尚不清晰，因此本研究擬進行探討，為臨床重用黃連治療DKD提供更多實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 黃連素、二甲基亞砜（DMSO）、干擾素-γ（IFN-γ）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）購自Sigma公司，青鏈霉素雙抗混合液、0.25%胰蛋白酶購自Solarbio公司，RPMI 1640購自Hyclon公司，胎牛血清購自Gibco公司，總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）試劑盒購自北京康為世紀(jì)有限公司。小鼠來源JAK2（AHO1352）和STAT3（MA1-13042）單抗購自ThermoFisherScientific公司，兔來源磷酸化 JAK2（phospho Tyr1007，GTX32203）和磷酸化 STAT3（phospho Tyr705，GTX24740）多抗購自GeneTex公司。

所用儀器為Nikon光學(xué)顯微鏡、Bio-Tek酶標(biāo)儀、Bio-rad凝膠圖像分析系統(tǒng)、ABI 7500型熒光定量PCR儀等。

1.2 方法

1.2.1 足細胞培養(yǎng)和分組 將凍存的MPC-5條件永生化小鼠足細胞復(fù)蘇，在含有10 U/mL IFN-γ、10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中，33℃、5%CO2培養(yǎng)箱傳代。傳代后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)用無IFN-γ的培養(yǎng)基培養(yǎng)10～14 d使細胞分化。

將細胞分為正常糖濃度組（5 mmol/L葡萄糖）、高糖濃度組（30 mmol/L葡萄糖）、高糖+10 μmol/L黃連素組、高糖+25 μmol/L黃連素組和高糖+50 μmol/L黃連素組。正常糖濃度組常規(guī)培養(yǎng)；其余各組使用相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

1.2.2 噻唑藍（MTT）法檢測足細胞存活率 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整密度為1×105/mL，接種于96孔板，每孔 100 μL，于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合后，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8 h使細胞同步。按上述實驗分組，加入相應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液10 μL，培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入150μLDMSO，混勻10min，采用酶標(biāo)儀于490 nm測定各孔的吸光度，計算細胞存活率。每組設(shè)5個復(fù)孔。

1.2.3 Transwell實驗檢測足細胞遷移能力 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整密度為1×105/mL，采用24孔transwell小室，上室加入200 μL細胞懸液，下室中加入600 μL完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合后，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8 h使細胞同步。按上述實驗分組，加入相應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出小室，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）漂洗，結(jié)晶紫染色，將上室中的細胞用棉簽擦去，倒置顯微鏡下觀察，每個樣本隨機選取10個視野，計算每個視野的細胞數(shù)。

1.2.4 白蛋白流量率檢測法測定足細胞屏障功能 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整密度為1×103/mL，采用24孔transwell小室，上室加入200 μL細胞懸液，下室中加入600μL完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合后，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8 h使細胞同步。按上述實驗分組，加入相應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，1×PBS洗滌2次，然后給上室更換完全培養(yǎng)基，下室更換含有40 mg/mL小牛血清白蛋白的完全培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)1 h后，取上層培養(yǎng)液，BCA法測定上層培養(yǎng)基中的白蛋白濃度。

1.2.5 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測基因表達 收集各組細胞，提取總RNA后測定純度和濃度，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA、上下游引物、熒光染料等加入反應(yīng)體系中，RT-qPCR法檢測。PCR反應(yīng)條件為件：95℃預(yù)變性10 min；變性95 ℃ 5 s；退火、延伸 60 ℃ 34 s；重復(fù) 40 個循環(huán)，70～95℃繪制融解曲線。反應(yīng)體系為25 μL。引物由蘇州金維智公司合成。引物序列：JAK2為5’-CGTCTCGGAGGAGCGGAT-3’和 5’-CTGGGGAGGGAAAACAGTTCA-3’；STAT3 為 5’-CGGATCGCTGAGGTACAACC-3’和 5’-TCAGGGGTCTCGACTGT-3’。GAPDH 為 5’-CTGCTCCTCCCTGTTCCA-3’和 5’-TGGCAACAATCTCCACTTTGC-3’。所有樣品重復(fù)檢測3次，2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測蛋白表達 收集各組細胞，RIPA提取液提取總蛋白，BCA法定量后，蛋白樣品進行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別與 JAK2（1∶1 000）、p-JAK2（1∶1 000）、STAT3（1∶1 000）、p-STAT3（1∶1 000）的Ⅰ抗雜交，再經(jīng)與HRP標(biāo)記的Ⅱ抗雜交、化學(xué)發(fā)光顯色等步驟，Bio-rad凝膠圖像分析系統(tǒng)測定光密度值。每個樣品重復(fù)測量3次，取均值分析。實驗以β-actin作為內(nèi)參照物。

2 統(tǒng)計分析

使用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析；組間多重比較采用LSD法（方差齊）/Dunnett’s T3法（方差不齊）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對足細胞存活率的影響 與正常糖濃度組相比，高糖刺激后足細胞存活率明顯降低（P＜0.01），而黃連素各組能不同程度促進足細胞存活，且呈濃度依懶性（P＜0.05，P＜0.01）。但黃連素 25 μmol/L 組與50 μmol/L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

3.2 對足細胞遷移能力的影響 與正常糖濃度組相比，高糖刺激能明顯增加足細胞的遷移能力（P<0.01），黃連素各組能明顯減少足細胞遷移，且呈濃度依懶性（P＜0.05，P＜0.01）。但黃連素 25 μmol/L 組與50 μmol/L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

3.3 對白蛋白流量率的影響 白蛋白流量率體現(xiàn)了足細胞的屏障功能。與正常糖濃度組相比，高糖刺激增加了白蛋白的滲漏，提示糖濃度提高削弱了足細胞單層屏障功能（P＜0.01）；而黃連素各組能不同程度降低白蛋白滲漏，說明黃連素能增強足細胞的屏障功能，且呈濃度依懶性（P＜0.05或P＜0.01）。但黃連素25 μmol/L組與50 μmol/L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表1 各組足細胞存活率比較（±s）Tab.1 Comparison of podocyte survival rates in each group（±s）%

表1 各組足細胞存活率比較（±s）Tab.1 Comparison of podocyte survival rates in each group（±s）%

注：與正常糖濃度組比較，*P＜0.01；與高糖濃度組比較，#P＜0.05；與高糖+10 μmol/L 黃連素組比較，△P＜0.05，。

組別正常糖濃度組高糖濃度組高糖+1 0 μ m o l/L黃連素組高糖+2 5 μ m o l/L黃連素組高糖+5 0 μ m o l/L黃連素組n 存活率5 1 0 0.1 2±3.2 6 5 4 1.1 5±2.1 8*5 4 4.0 6±3.4 3*5 5 2.4 9±2.7 5*#△5 5 5.2 2±4.1 0*#△

表2 各組足細胞遷移能力比較（±s）Tab.2 Comparison of migration ability of podocytes in each group（±s）%

表2 各組足細胞遷移能力比較（±s）Tab.2 Comparison of migration ability of podocytes in each group（±s）%

注：與正常糖濃度組比較，*P＜0.01；與高糖濃度組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與高糖+10 μmol/L 黃連素組比較，△P＜0.05。

組別正常糖濃度組高糖濃度組高糖+1 0 μ m o l/L黃連素組高糖+2 5 μ m o l/L黃連素組高糖+5 0 μ m o l/L黃連素組n 遷移能力5 1 0 0.0 0±0.5 8 5 2 5 1.4 0±2.8 2*5 2 0 3.2 5±2.7 4*#5 1 6 5.6 1±1.6 6*##△5 1 5 2.2 2±2.9 4*##△

3.4 對JAK2和STAT3 mRNA表達的影響 與正常糖濃度組相比，高糖刺激能增加JAK2和STAT3 mRNA表達量（P＜0.01）；而黃連素各組能不同程度降低其表達，且呈濃度依賴性（P＜0.05或P＜0.01）。但黃連素25 μmol/L組與50 μmol/L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

表3 各組足細胞屏障功能比較（±s）Tab.3 Comparison of podocyte function of each group（±s） μg/mL

表3 各組足細胞屏障功能比較（±s）Tab.3 Comparison of podocyte function of each group（±s） μg/mL

注：與正常糖濃度組比較，*P＜0.01；與高糖濃度組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與高糖+10 μmol/L 黃連素組比較，△P＜0.05。

組別正常糖濃度組高糖濃度組高糖+1 0 μ m o l/L黃連素組高糖+2 5 μ m o l/L黃連素組高糖+5 0 μ m o l/L黃連素組n 白蛋白濃度5 6.9 4±1.2 1 5 2 9.3 6±4.3 7*5 2 3.0 6±3.2 2*#5 1 6.2 6±3.1 7*##△5 1 3.1 9±3.5 2*##△△

表4 各組足細胞JAK和STAT mRNA表達比較（±s）Tab.4 Comparison of JAK and STAT mRNA expression in podocytes of each group（±s）%

表4 各組足細胞JAK和STAT mRNA表達比較（±s）Tab.4 Comparison of JAK and STAT mRNA expression in podocytes of each group（±s）%

注：與正常糖濃度組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高糖濃度組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與高糖+10 μmol/L 黃連素組比較，△P＜0.05。

組別 n正常糖濃度組 5高糖濃度組 5高糖+1 0 μ m o l/L黃連素組 5高糖+2 5 μ m o l/L黃連素組 5高糖+5 0 μ m o l/L黃連素組 5 J A K m R N A 1.0 0±0.0 9 2.3 2±0.2 2**2.1 5±0.1 5**1.6 4±0.1 3**##△1.5 2±0.1 0**##△S T A T m R N A 1.0 0±0.1 2 1.8 6±0.1 7**1.6 6±0.1 9**#1.4 5±0.1 3**##△1.3 5±0.0 8*##△

3.5 對JAK2和STAT3蛋白表達的的影響 與正常糖濃度組相比，高糖刺激增加JAK2和STAT3總蛋白及磷酸化蛋白的表達量（P＜0.05）；而黃連素各組能不同程度降低其總蛋白及磷酸化蛋白的表達量，且在一定程度上呈濃度依懶性（P＜0.05），見圖1。

4 討論

圖1 各組足細胞JAK和STAT蛋白表達比較（±s）Fig.1 Comparison of JAK and STAT protein expression in podocytes of each group（±s）

足細胞是維持腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)和功能完整的重要細胞。足細胞是腎小球臟層上皮細胞，高糖、糖基化終末產(chǎn)物、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等都可損傷足細胞，導(dǎo)致其向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化并獲得分泌功能，分泌細胞外基質(zhì)增多，最終導(dǎo)致腎小球硬化[11]。足細胞結(jié)構(gòu)和功能的異常導(dǎo)致腎小管萎縮和功能損傷，是導(dǎo)致蛋白尿并促使DKD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，因此減輕足細胞損傷是治療DKD的關(guān)鍵。

JAK-STAT信號通路的激活與DKD的發(fā)病密切相關(guān)。高糖、糖基化終末產(chǎn)物、血管緊張素Ⅱ、過氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮生長因子等多種能促進DKD發(fā)展發(fā)展的病理因素，均能激活JAK2/STAT3通路[12]。在早期或進展性DKD患者中，腎小球和腎小管間質(zhì)中JAK和STAT基因各亞型的表達均大幅增加[3]。而baricitinib（JAK1和JAK2選擇性抑制劑）可減少DKD患者的蛋白尿，甚至在停藥4周后，中高劑量組減少蛋白尿的作用仍能維持[5]。使小鼠足細胞過表達JAK2，發(fā)現(xiàn)對無糖尿病小鼠沒有任何影響；但卻導(dǎo)致糖尿病小鼠尿白蛋白明顯增加、系膜擴張、足細胞密度減少、腎小球硬化和腎小球基底膜增厚?？诜﨡AK1/JAK2抑制劑兩周后，上述病理變化顯著改善[4]。給予STAT3活性降低的轉(zhuǎn)基因小鼠以鏈脲佐菌素，使其發(fā)生糖尿病，該小鼠在蛋白尿、系膜擴張、細胞增殖、巨噬細胞浸潤、炎癥和異?；|(zhì)合成等方面均降低[13]；口服JAK1/JAK2抑制劑可使STAT3等許多與DKD進展有關(guān)的下游基因的表達恢復(fù)正常。上述研究結(jié)果提示，足細胞內(nèi)JAK2及STAT3的活化及表達增加對DKD發(fā)生發(fā)展非常關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)使足細胞存活率降低、遷移能力提高；并使JAK2和STAT3 mRNA和蛋白表達量提高。提示高糖刺激損傷了足細胞的屏障功能，而這一作用與JAK2/STAT3通路活性升高相關(guān)。

黃連素是從黃連、黃柏等中藥中提取出的一種生物堿，對與DKD密切相關(guān)的病理機制，如糖脂代謝、胰島素抵抗[14]、炎癥[8]、氧化損傷[15]等均有改善；因而具有良好的腎保護作用。黃連素能有效緩解早期DKD患者的臨床癥狀，降低其空腹血糖、糖化血紅蛋白及尿微量白蛋白排泄率[16]。黃連素能降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DKD大鼠的空腹血糖、腎質(zhì)量體質(zhì)量比、24 h尿蛋白、血肌酐和血尿氮水平；還可減輕DKD大鼠全身及腎臟的炎癥反應(yīng)[8]。黃連素可抑制由高糖所導(dǎo)致的腎小球系膜細胞的增殖與肥大、改善腎小球纖維化，其機制涉及調(diào)節(jié)細胞周期蛋白表達，使細胞周期停滯于G1期[17]；抑制鞘氨醇激酶-1-磷酸鞘氨醇（SphK/S1P）通路活性[18]；抑制激活蛋白 1（AP-1）活化[19]；抑制核因子 κB（NF-κB）的核移位和轉(zhuǎn)錄活性，進而抑制其下游靶基因轉(zhuǎn)錄[20]等多種信號通路。黃連素對足細胞也有保護作用，其改善足細胞的結(jié)構(gòu)和功能、抑制足細胞凋亡的機制與抑制 TLR4/NF-κB[8]、PI3K-Akt[9]通路，增強 AMPK活性[10]等有關(guān)。最新研究表明，黃連素可以通過降低動力相關(guān)蛋白1（Drp1）激活來保護足細胞線粒體的結(jié)構(gòu)與功能，從而使足細胞免于凋亡[21]。但目前尚未見黃連素調(diào)節(jié)JAK-STAT通路進而保護足細胞的相關(guān)報道。本研究結(jié)果表明，黃連素對高糖引起的足細胞功能損傷具有明顯的保護作用，黃連素各濃度均能提高足細胞的存活率，減少其遷移能力，改善其屏障功能；且均能降低JAK2和STAT3 mRNA及蛋白的表達。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，均發(fā)現(xiàn)過表達JAK2導(dǎo)致足細胞密度減少；且也證實黃連素對足細胞屏障功能的改善作用，與調(diào)節(jié)JAK-STAT通路活性相關(guān)。

綜上所述，黃連素能保護高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷，提高足細胞在高糖環(huán)境下的存活率、降低其遷移率，維持其屏障功能，其機制可能與調(diào)控JAK2和STAT3基因與蛋白表達有關(guān)。